玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠视网膜脑源性神经营养因子表达的研究

摘要

目的:
　　观察由人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)体外诱导的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)经玻璃体腔途径移植到糖尿病大鼠眼内后，视网膜内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表达的变化和胸腺肽-1(thymosin-1,Thy-1)阳性表达的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的变化情况，探讨璃体腔移植hUCMSCs诱导的NSCs在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的可能神经保护作用，为DR的临床防治提供基础理论依据。
　　方法；
　　采用神经分化培养基体外诱导hUCMSCs向NSCs定向转化，倒置显微镜下观察细胞形态变化。免疫荧光染色检测NSCs标志物巢蛋白和神经源性分化因子1(neurogenic differentiation factor1, NeuroD1)表达情况。成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley, SD)大鼠52只，采用随机数字表法分为正常对照组(A组)和糖尿病组。链尿佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1个月，将糖尿病组大鼠随机分为DR对照组(B组)，玻璃体腔注射hUCMSCs组(C组)，玻璃体腔注射hUCMSCs诱导的NSCs组(D组)。各组均为13只大鼠。干预后2、4、6、8周，免疫组织化学染色观察视网膜BDNF及Thy-1阳性染色情况，Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析视网膜阳性染色区的平均累积光密度值(integrated optic density, IOD)，并对Thy-1阳性染色的RGCs计数。SPSS20.0统计学软件进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1. hUCMSCs在神经培养基诱导3天时，60-70％细胞开始聚集形成大小不等的细胞簇，随着培养时间的增加，逐渐形成悬浮的细胞团并增大、增多。
　　2.免疫荧光染色示20天时诱导的hUCMSCs高表达NSCs的特异性标志巢蛋白和NeuroD1，阳性细胞表达量分别占87.3%和72.6%。
　　3.糖尿病大鼠成模38只，成模率97.43%。本实验共有26只大鼠行玻璃体腔注射，其中2只大鼠发生玻璃体腔出血，最终各组大鼠均为12只纳入研究。
　　4.免疫组织化学染色示：(1) BDNF：A组大鼠视网膜BDNF表达阳性，各层均有表达。B组呈弱阳性表达，随干预后时间延长，染色强度呈减弱趋势。C组、D组染色强度随干预后时间延长而增强，D组染色较同期B组、C组更深。B组BDNF表达随时间逐渐减少，C组、D组BDNF表达随时间逐渐增加，D组更为明显，组内各时间点间比较差异均有显著性(F=20.325、13.540、16.896， P=0.000)。除干预后2周时C组较B组BDNF表达无明显变化，余各时间点各组间 BDNF表达差异均有统计学意义(F=37.144、27.419、83.659、89.654， P=0.000)。(2) Thy-1：A组 Thy-1呈阳性表达，主要表达于神经节细胞层(ganglioncelllayer，GCL)和内丛状层(inner plexiform layer，IPL)层。B组染色强度明显减弱，且随干预后时间延长染色强度逐渐降低。C、D组随干预后时间延长其染色深度逐渐增强，D组染色更深。B组Thy-1表达随时间逐渐减少，C组、D组Thy-1表达随时间逐渐增加，D组更为明显，除B组、D组干预后6周较8周 Thy-1表达无明显改变，余组内各时间点间比较差异均有显著性(F=16.087、15.239、10.950，P=0.000)。除干预后2周时C组较B组Thy-1表达无明显变化，余各时间点各组间Thy-1表达差异均有统计学意义(F=26.463、51.360、61.820、101.597，P=0.000)。(3) RGCs计数：A组大鼠视网膜Thy-1阳性RGCs数目每高倍镜视野(×400)约33个，B组RGCs数随时间逐渐减少，C组、D组随时间RGCs数逐渐增多，D组大鼠更为明显，但均低于同期A组的大鼠RGCs数目，组内不同时间点差异均有统计学意义(F=7.273、17.606、16.290，P=0.000)。除干预后2周C组较B组RGCs无明显差异，B组、C组、D组余各时间点各组间差异均有统计学意义(F=100.333、117.404、70.212、90.012，P=0.000)。
　　5. BDNF蛋白表达量与RGCs数量相关性分析结果显示BDNF的平均IOD值与RGCs数量呈正相关关系(r=0.964，P=0.000)。
　　结论：
　　1.体外hUCMSCs能够定向诱导为NSCs，并高表达NSCs标志物巢蛋白和NeuroD1。
　　2. STZ诱导的糖尿病大鼠6周时已经存在RGCs的丢失。hUCMSCs诱导的NSCs经玻璃体腔移植后能够减少RGCs的丢失。
　　3. hUCMSCs诱导的NSCs经玻璃体腔途径移植到STZ诱导的糖尿病大鼠眼内，能够促进视网膜BDNF的表达。
　　4. hUCMSCs诱导的NSCs对糖尿病大鼠视网膜的RGCs的保护作用可能与其促进BDNF的表达有关。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1 对象

2 方法

结果

1 倒置显微镜观察hUCMSCs诱导结果

2 免疫荧光染色检测NSCs的标志物

3 大鼠模型一般情况

4. 免疫组织化学染色的观察

5 Thy-1阳性RGCs细胞计数

6 BDNF蛋白表达量与RGCs数量相关性分析

讨论

1 hUCMSCs诱导为NSCs

2 DR早期RGCs变化的机制

3 BDNF在DR中的神经保护作用

4 hUCMSCs在DR中的应用

5 Thy-1蛋白在标记RGCs中的应用

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:糖尿病视网膜病变神经损伤的发病机制和保护防治研究进展

致谢