叶酸对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤保护作用机制的研究

摘要

目的：
　　多种血管疾病的初期均会出现血管内皮细胞损伤的病理生理改变，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发生的重要环节之一，因此保护血管内皮细胞对于防治AS相关疾病有着重要的意义。流行病学研究和基础研究均表明在AS的发生早期常伴有高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteine， HHcy）。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）会引起血管内皮细胞的损伤，进而促进AS的发生。叶酸作为辅酶参与Hcy代谢。本研究观察叶酸（folic acid， FA）对Hcy引起的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）损伤的保护作用，探讨其中机制，为AS防治提供科学依据。
　　方法：
　　本实验采用不同浓度叶酸（0-1000 nmol/L）作用于HUVEC48 h（前24h同时进行1000μmol/L Hcy孵育及空白对照）。分别采用MTT法检测不同浓度叶酸作用下 HUVEC细胞活性，计算细胞生长抑制率；丙二醛（ methane dicarboxylic aldehyde，MDA）测定试剂盒检测细胞中MDA含量；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒检测细胞培养液中LDH活性；化学发光微粒子免疫法检测细胞中叶酸水平；高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）检测细胞内 Hcy、S-腺苷同型半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine，SAH）和S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，SAM)水平；RT-PCR检测血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的mRNA表达水平；免疫印迹（Western Blot）检测VEGF、MCP-1的蛋白表达水平；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒检测细胞的总抗氧化能力；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒测定细胞 SOD活性；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒检测细胞中GSH含量；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒检测细胞GSH-Px活性；流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡率；RT-PCR检测抑制凋亡基因Bcl2的mRNA水平和促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6、Caspase-8和Caspase-9的mRNA水平；Caspase-3/7检测试剂盒检测细胞中Caspase-3/7活性。
　　结果：
　　与正常对照组（叶酸浓度为20 nmol/L）相比，Hcy干预降低了细胞活性，升高了细胞生长抑制率。对照组细胞排列整齐紧密，Hcy干预后细胞排列疏松。叶酸干预使细胞形态明显改善，细胞数目显著增多，且叶酸高剂量组作用最明显。叶酸作用于Hcy孵育的细胞后，增强了细胞活性，降低了细胞生长抑制率。叶酸干预降低了细胞氧化损伤程度，与 Hcy+FA-N组相比，Hcy+FA-H组细胞MDA含量减少、LDH活性降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。叶酸增强了细胞的抗氧化能力，与Hcy+FA-N组相比，Hcy+FA-H组细胞总抗氧化能力（T-AOC）、SOD活性、细胞内GSH含量和GSH-Px活性均升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。叶酸降低了细胞中Hcy、SAH浓度，升高了SAM浓度。叶酸可提高VEGF的mRNA和蛋白的表达水平，降低MCP-1的mRNA和蛋白的表达水平。叶酸上调了抑制凋亡基因Bcl2的mRNA表达水平，下调了促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4和Caspase-8的mRNA表达水平，具有统计学意义（P＜0.05）。促凋亡基因Caspase-6和Caspase-9的mRNA水平在各组之间无差异（P＞0.05）。叶酸降低了细胞的Caspase-3/7活性。
　　结论：
　　叶酸可改善由 Hcy引起的细胞损伤，提高细胞活性，降低生长抑制率，改善内皮功能，增强细胞的抗氧化能力，降低细胞凋亡率，叶酸对 Hcy引起的内皮细胞损伤具有一定的保护作用。其可能的机制为叶酸通过调节与AS进展相关的VEGF和MCP-1的基因和蛋白的表达水平改善内皮功能；叶酸通过调节细胞中抗氧化物质的含量及相关酶活性增强细胞的抗氧化能力；叶酸降低Caspase-3/7活性，上调抑制凋亡基因 Bcl2的表达，下调促凋亡基因 TP53、Caspase-3、Caspase-4和Caspase-8的表达。对Hcy引起的内皮细胞损伤，补充适宜剂量的叶酸可起到一定的保护作用。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、叶酸对Hcy诱导的HUVEC损伤模型的影响

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3讨论

1.4 小结

二、叶酸对Hcy诱导的HUVEC损伤模型作用机制研究

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:动脉粥样硬化相关膳食因素研究

致谢

个人简历