线粒体微粒在创伤性脑损伤相关凝血功能障碍中的作用机制研究

摘要

目的：创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）相关凝血功能障碍（traumatic brain injury-associated coagulopathy, TBI-AC）发生和死亡率高，其发生机制尚不明确。课题组前期已发表的研究显示，小鼠 TBI后损伤的神经元和神经胶质细胞可释放脑源性微粒（brain derived microparticles, BDMP）通过破坏的血脑屏障进入外周循环血中引起系统性凝血功能障碍（Blood2015）。本研究将在此基础上，继续研究BDMP的亚型线粒体微粒（mitochondrial microparticles, mtMPs）在TBI后小鼠外周血中的含量及其在TBI-AC中的作用，并通过体外提取mtMPs，检测其对凝血相关细胞的作用。同时检测微粒清除蛋白Lactadherin对mtMPs介导的TBI-AC的治疗作用。本研究将丰富TBI-AC发病机制的理论，并探索新的TBI-AC及TBI继发性损伤的治疗方法。
　　方法：（1）通过小鼠 TBI模型，检测小鼠创伤性脑损伤后外周血抗脑抗体的变化。（2）体外实验检测心磷脂（cardiolipin, CL）的促凝活性，并通过尾静脉给予正常小鼠体内注射不同剂量的CL，检测CL在正常小鼠体内的促凝作用。通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观测CL形成胶团结构。（3）通过流式细胞术、RT-PCR和扫描电子显微镜（ transmission electron microscopy, TEM）检测小鼠 TBI后外周血中 mtMPs的释放，同时检测 CL与mtMPs的关系。（4）通过流式细胞术，免疫磁珠分选和多步离心法三种不同方法体外提取mtMPs，并通过流式细胞术和TEM对其表型和形态进行鉴定。（5）体外检测mtMPs的促凝作用，并通过小鼠尾静脉给予正常小鼠体内注射mtMPs，通过凝血因子X激活凝血时间实验，ELISA法检测外周血D-dimer含量和组织病理染色，检测 mtMPs在正常小鼠体内的促凝作用。（6）通过流式细胞术和RT-PCR检测体外培养的神经元和神经胶质细胞mtMPs的释放。（7）检测mtMPs或CL是否可以激活血小板及其潜在机制。（8）检测mtMPs或CL对血管内皮细胞间屏障完整性和对内皮细胞的激活。（9）体外检测Lactadherin蛋白对mtMPs介导的促凝作用的抑制作用。
　　结果：（1）小鼠TBI后外周血中，在伤后10天开始可检测到抗CL抗体，同时CL胶团在体内及体外具有促凝活性，其在体内可促进小鼠肺组织血管纤维素沉积和微血栓形成。（2）小鼠TBI后6h，检测到脑组织中损伤的神经元和胶质细胞系中线粒体以微粒形式，即线粒体微粒（mtMPs）释放至外周血中，其含量可达到17,547±2,677/μl，mtMPs表面暴露CL。这种mtMPs占到了整个Annexin V+微粒的55.2±12.6％。同时，体外培养的神经细胞系和胶质细胞系在凋亡状态下可释放mtMPs。体外提取的mtMPs可以协同血小板促进内皮细胞的渗漏。（3）正常小鼠经鼠尾静脉注射入mtMPs30min后，可导致小鼠外周血呈现高凝状态，凝血酶升高，同时可在小鼠肺组织中检测到血管纤维素沉积及肺组织间水肿。（4）mtMPs介导的促凝作用主要是通过线粒体内膜上CL转移至外膜而介导的，其促凝作用可以被微粒清除系统蛋白 Lactadherin所阻断，而这种 mtMPs上的CL的促凝作用是相同浓度纯化的CL胶团的1600倍。Lactadherin还可以减少经mtMPs注射小鼠的死亡率。
　　结论：（1）TBI后损伤的神经细胞释放mtMPs至外周循环血中，mtMPs表面含有大量CL（2）表面暴露CL的mtMPs具有高的促凝活性，其可以引起TBI后凝血功能障碍的发生。（3）微粒清除蛋白Lactadherin可以抑制CL和mtMPs的促凝作用，其还可以减少注射了mtMPs小鼠的死亡率。本研究揭示了一种新的表面暴露CL的mtMPs介导的TBI相关凝血功能障碍发生的机制，并初步探索了一种潜在的抑制这种促凝机制治疗TBI-AC的方法。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、创伤性脑损伤小鼠自身抗体的检测及心磷脂的促凝活性

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、创伤性脑损伤小鼠外周血中mtMPs含量及其促凝功能检测

2.1 对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、mtMPs促凝机制的体外研究

3.1 对象和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

四、微粒清除蛋白Lactadherin对mtMPs的作用

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 微粒与创伤性脑损伤后凝血功能障碍的研究进展

致谢

个人简历