自噬对糖尿病足患者感染铜绿假单胞菌作用的研究

摘要

目的：1.通过比较糖尿病足（diabetic foot，DF）患者创面感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）及感染控制期创面组织中自噬相关蛋白表达差异，探究 PA对自噬的影响。2.研究感染多重耐药铜绿假单胞菌（Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）以及合并缺血对自噬的影响。3.PA的Ⅲ型分泌系统（typeⅢ secretion system，T3SS)分泌不同毒力蛋白对自噬的影响。
　　方法：1.收集2016年3月-2017年2月于天津医科大学代谢病医院糖尿病足科住院治疗的24例DF感染PA患者的临床资料；根据是否感染MDRPA分为两组，根据是否缺血分为两组，标准化治疗感染控制前后分为感染期和感染控制期。2.所有纳入患者创面清创后深部取材，并将所取组织分为3部分。一部分用于细菌培养及药敏试验、创面菌落计数并冻存菌株，通过PCR鉴定PA的T3SS所携带的毒力基因。一部分用于制作石蜡切片：HE染色观察患者创面组织病理学改变；免疫组织化学染色，半定量检测患者创面组织内细胞自噬相关蛋白 LC3（Microtubule-associated protein1 light chain3）、Beclin-1和P62的平均光密度值；免疫荧光双染色，定性检测患者创面组织中巨噬细胞的自噬水平。最后一部分蛋白印迹定量测定LC3-II/I、Beclin-1和P62的蛋白表达量。3.感染控制后同上述方法测量上述指标。
　　结果：1.DF患者感染期与感染控制期比较，感染控制期炎症指标（白细胞计数、中性粒细胞百分比、血沉和超敏C反应蛋白）较感染期下降、创面菌落计数下降、果糖胺下降、创面面积缩小（P＜0.05），余一般资料未见差异（P＞0.05）。MDRPA组炎症指标（中性粒细胞百分比、血沉和超敏C反应蛋白）以及创面内细菌菌落数较N-MDRPA组高（P＜0.05）。缺血组较非缺血组ABI低、创面面积大（P＜0.05）。2.与感染期相比，感染控制期创面组织中新生的毛细血管、成纤维细胞较多，炎症细胞较少；免疫组织化学法显示创面组织中LC3和Beclin-1表达较高、P62表达较少（P＜0.05）；免疫荧光显示芽组织LC3与巨噬细胞标记物CD14 Merge后，巨噬细胞自噬水平较高；蛋白印迹显示LC3-II/I和Beclin-1表达较高、P62表达较低（P＜0.05）。与MDRPA组相比，N-MDRPA组炎症细胞浸润较少，创面组织中新生的毛细血管、成纤维细胞相比无明显差异；免疫组织化学法显示LC3的表达较高（P＜0.05），Beclin-1和P62表达无统计学意义（P＞0.05）；免疫荧光显示芽组织LC3与巨噬细胞特异性标记物CD14 Merge后，巨噬细胞自噬水平较高；蛋白印迹法显示创面组织中LC3-II/I表达较高（P＜0.05），Beclin-1、P62的表达无统计学意义（P＞0.05）。与缺血组相比，非缺血组创面组织中新生的毛细血管、成纤维细胞以及炎症细胞较多；免疫组织化学法显示创面组织中LC3和Beclin-1表达较高、P62表达较低（P＜0.05）；免疫荧光显示芽组织LC3与巨噬细胞特异性标记物CD14 Merge后，巨噬细胞自噬水平较高；蛋白印迹法显示创面组织中LC3-II/I和Beclin-1表达较高、P62表达较低（P＜0.05）。3.感染期real-time PCR检测送检细菌均携带毒力基因exoS。
　　结论：PA感染控制以及代谢紊乱改善后，自噬水平升高，这提示严重的代谢紊乱可能下调自噬，PA可能通过某种机制下调甚至逃避细胞自噬，MDRPA感染时，细胞自噬水平进一步降低，说明MDRPA逃避自噬的能力可能更强。合并缺血的DFI自噬水平进一步降低，适度诱导自噬或许可以作为治疗DF合并PA感染的新手段。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、糖尿病足患者创面感染铜绿假单胞菌的临床特点分析

1.1实验材料

1.2研究对象和方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

二、糖尿病足患者创面感染PA对自噬表达的探究

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:铜绿假单胞菌与自噬的相互作用机制

致谢

个人简历