基于巨噬细胞免疫应答机制构建新型多糖复合水凝胶治疗糖尿病溃疡的基础研究

摘要

目的：
　　随着糖尿病及其主要并发症糖尿病足溃疡的发病率日益增高，为改善其所造成的经济损失及截肢等后果，本研究旨在合成一种类似于细胞外基质的新型功能化复合水凝胶材料，通过负载白细胞介素4（IL-4）对巨噬细胞进行免疫调控，诱导其分化为选择性激活的巨噬细胞即M2亚型，从而分泌抗炎性细胞因子发挥抗炎性作用，以促进糖尿病足溃疡伤口的快速愈合。
　　方法：
　　以壳聚糖和葡聚糖为主要原料合成巯基化壳聚糖（CS-SH）和马来酸葡聚糖（Dex-Ma），再通过Michael加成反应制备得到新型功能化复合水凝胶即巯基化壳聚糖/马来酸葡聚糖（CS-SH/Dex-Ma，CSDM）复合水凝胶。通过调节巯基含量与马来酸含量构筑一系列不同比例的水凝胶，利用核磁共振谱仪和傅里叶红外光谱仪分析其结构，运用扫描电子显微镜（SEM）观察该凝胶的微观结构，并对其溶胀动力学和流变学等特性进行测定评价，同时运用四甲基偶氮唑盐（MTT）法评估水凝胶的生物相容性。基于上述关于水凝胶的基本性能评价后，进一步对水凝胶进行负载 IL-4药物实验，同时用该载药水凝胶对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）进行干预评价，实验设立五组，分别为正常对照（NC）组、脂多糖（LPS）组、IL-4组、水凝胶（CSDM）组及水凝胶+IL-4（CSDM+IL-4）组，于显微镜下对干预后的各组细胞形态进行观察并拍照记录，利用总一氧化氮检测试剂盒测定干预后各组细胞上清液中的NO含量，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测水凝胶及药物干预细胞后各组上清液中肿瘤坏死因子?（TNF-?）和白细胞介素10（IL-10）的分泌情况，以及通过实时定量多聚酶链反应（qPCR）检测干预后各组的 RAW264.7巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶-1（Arg-1）的相对表达情况。
　　结果：
　　通过调节巯基含量与马来酸含量制备出5种比例的水凝胶，即巯基与双键的摩尔比分别为1:4、1:2、1:1、2:1和4:1（CS1DM4、CS1DM2、CS1DM1、CS2DM1、CS4DM1），通过核磁与红外测试均可证明水凝胶成功合成，SEM下观察水凝胶具有三维多孔状结构，孔径为5μm左右，该结构为水凝胶发挥其功能的基础条件；同时这种多孔结构可使水凝胶的溶胀率在60min内基本达到溶胀平衡，溶胀率高达为400%，随着时间的延长，水凝胶的溶胀率持续升高，最高达700%，结果显示该凝胶具有良好的吸水功能；水凝胶的流变学结果显示，随着角频率的逐渐增长（0.1～100 rad/s），所得水凝胶的 G'值均大于 G

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1 主要材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 巯基化壳聚糖（CS-SH）的制备

1.4 马来酸葡聚糖（Dex-Ma）的制备

1.5 CS-SH巯基含量的测定

1.6 Dex-Ma取代度的测定

1.7 CS-SH/Dex-Ma复合水凝胶的制备

1.8 水凝胶的核磁及红外表征

1.9 水凝胶扫描电镜下形态学表征

1.10 水凝胶溶胀性能测试

1.11 水凝胶流变学性能测试

1.12 水凝胶生物相容性（细胞毒性）评价

1.13 负载IL-4的CSDM水凝胶的体外研究

2 结果

2.1 CS-SH的成功制备及其巯基含量

2.2 Dex-Ma的成功制备及马来酸取代度

2.3 CS-SH/Dex-Ma水凝胶的成功合成

2.4 CS-SH/Dex-Ma水凝胶的形态学

2.5 CS-SH/Dex-Ma水凝胶的溶胀性能

2.6 CS-SH/Dex-Ma水凝胶的流变性能

2.7 CS-SH/Dex-Ma水凝胶的生物相容性

2.8 RAW264.7巨噬细胞的形态变化

2.9 RAW264.7巨噬细胞释放NO水平的测定

2.10 ELISA法检测RAW264.7巨噬细胞TNF-?和IL-10水平

2.11 qPCR法检测RAW264.7巨噬细胞iNOS和Arg-1 mRNA相对表达量

3 讨论

3.1 糖尿病足溃疡及伤口愈合过程

3.2 CSDM水凝胶的基本性能

3.3 负载IL-4的CSDM水凝胶的细胞学相关测试

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:巨噬细胞在糖尿病足溃疡组织修复中作用的研究进展

致谢

个人简历