持久性有机污染物长期暴露导致端粒功能障碍造成个体衰老的研究

摘要

目的： 持久性有机污染物（POPs）是一类具有脂溶性、毒性和生物蓄积性，可远距离迁移，且难以降解，能在环境中持久存在的天然或人工合成的有机污染物质。POPs的积累能造成广泛的生殖、免疫及神经系统毒性，其危害得到社会的高度重视。本课题前期队列研究发现，POPs暴露人群出现严重的细胞凋亡及生殖器官衰老、免疫退化等组织退行性改变。通过本项目，我们系统地研究了POPs暴露对染色体稳定性、基因组表观修饰、端粒损伤、炎症反应等方面的影响，明确了POPs诱导器官衰老及组织退行性变化的分子机制和信号通路，为环境诱发的衰老相关疾病的干预方案提供指导。 方法： (1)样品采集地区分为暴露区和对照区，其中暴露区为天津市静海县原电子垃圾处理基地附近村庄，对照区（非暴露区）为与暴露区地理距离不小于40公里。暴露区与对照区人群的生活状态、饮食习惯相近。对不同地区人群，进行常规健康体检，收集外周血12mL（肝素抗凝、EDTA抗凝、促凝全血各4mL），同时对目标人群的年龄、患病史及生育史等，以问卷形式进行调查，通过统计分析，明确POPs暴露对高血压、糖尿病、自身免疫性疾病和生殖系统疾病等衰老性疾病发生的影响。 (2)通过免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术和胞质分裂阻滞微核（Cytokinesis-block micronucleus，CBMN）实验检测POPs累积对人群外周血白细胞中DNA损伤程度和毒性作用。 (3)通过荧光原位杂交（Fluorescence in situhybridization，FISH）、免疫荧光结合荧光原位杂交（IF-FISH）的技术比较暴露区人群中端粒异质性和特异性损伤的比例，探讨POPs暴露造成端粒DNA损伤的特异性；通过FISH、端粒DNA实时定量PCR以及端粒DNA Southern Blot等多种技术，测量人群外周血白细胞端粒长度及端粒损伤水平，评估POPs暴露对端粒的特异性影响；通过血液中POPs不同组分浓度与端粒长度的关联分析，明确造成器官衰老、个体退行性病变的关键POPs组分。 (4)通过高分辨率熔解曲线（HRM）技术检测POPs暴露对外周血DNA LINE-1甲基化水平的影响，通过亚硫酸盐测序（RRBS）技术检测POPs暴露对亚端粒区DNA的甲基化水平影响，明确POPs暴露对基因组特别是亚端粒区基因表观遗传学变化的影响；通过定量PCR技术检测亚端粒区RNA（TERRA）的表达，进一步明确POPs暴露对端粒功能的影响；通过C-circle技术检测端粒延长替代机制（ALT）是否活化，明确POPs暴露是否具有激活端粒延长机制并诱发癌症发生的潜能。 (5)通过酶联免疫吸附试验（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和定量PCR检测衰老相关通路p16INK4a-Rb和p14ARF-p53中关键因子的表达情况，明确POPs对污染区人群衰老的影响；通过ELISA检测炎症相关细胞因子白细胞介素（Interleukin，IL）-6、IL-10、IL-2、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子（Nuclear factor-κB,NF-κB）的分泌情况，明确慢性炎症的在POPs暴露区人群中的诱导发生，尝试发现、鉴定POPs暴露导致的个体衰老预警标志物。 结果： (1)2009-2016间收集的5955例调查问卷显示，POPs暴露区人群高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、自然流产的发生率普遍高于对照区人群，说明长期的POPs暴露可以增加衰老相关疾病的发生风险。 (2)免疫荧光和微核实验结果显示，POPs暴露区人群外周血白细胞中，DNA损伤标记蛋白53BP1阳性（≥5dots）细胞比例显著高于POPs非暴露区人群；POPs暴露区人群外周血细胞的微核率明显升高。这些结果显示长期的POPs暴露会造成严重的人体内DNA损伤和遗传物质不稳定。 (3)荧光原位杂交和免疫荧光-荧光原位杂交结果显示，POPs暴露能够导致明显的端粒区DNA损伤，同时发现暴露区人群端粒丢失和多端粒信号的比例也明显升高；荧光原位杂交、定量PCR、Southern blot结果显示，暴露区人群外周血DNA的端粒长度明显短于非暴露区人群；同时，我们将人群的端粒长度与相应的血清POPs组分进行相关性分析发现PBDE184与端粒长度呈现明显的负相关。这些结果表明长期的POPs暴露可以导致端粒长度缩短和端粒功能障碍，影响端粒的正常保护功能。 (4)HRM和RRBS的结果显示，暴露区人群外周血LINE-1DNA和一些染色体亚端粒区DNA的甲基化水平降低；TERRA的定量结果显示，暴露区人群外周血中染色体20q，Xp/Yp的TERRA表达显著高于对照区人群，并且TERRA的表达和相应样本的端粒长度呈现出明显的负相关；C-circle的结果显示，POPs的长期暴露会激活机体的端粒延长替代机制（ALT）机制。这些结果表明POPs的长期暴露可造成机体全基因组和亚端粒区DNA甲基化水平改变进而影响TERRA的表达，而TERRA的上调可能激活了ALT机制，此结果同我们之前观察到的暴露区人群样本端粒区明显升高的异质性和上调的DNA同源重组基因相吻合。 (5)ELISA和定量PCR结果显示，POPs暴露区人群外周血血浆中，衰老相关通路中P53、Rb、P16INK4a和P14ARF蛋白表达显著升高；p53和Rb的mRNA表达水平也明显增加；此外，同对照区相比，POPs暴露区人群血浆中衰老相关表型相关因子IL-6,TNF-α分泌增多，炎症相关因子IL-10的分泌增多，IL-2分泌减少，表明POPs的长期暴露会激活衰老相关的通路，诱导机体慢性炎症反应的发生，加速衰老。 结论： POPs长期暴露下，人群更易罹患高血压、糖尿病、自身免疫性疾病等老年性疾病，并影响育龄期妇女的生育，对人群健康产生不利影响。长期的POPs暴露可导致基因组不稳定性增加，诱导端粒长度的缩短和端粒功能障碍，影响端粒的正常保护功能，促进衰老相关疾病发生。此外，POPs长期暴露可造成机体DNA甲基化水平改变从而促进TERRA的表达，进一步影响端粒的结构和功能，诱导衰老，同时染色质状态的改变激活ALT，增加暴露个体衰老发生风险。同时，POPs的长期暴露激活NF-κB通路，造成SASP和免疫紊乱，诱导慢性炎症，加速衰老和退行性疾病的发生。POPs长期暴露激活了p16INK4a-Rb和p14ARF-p53这两条主要的衰老相关的通路，诱导了细胞、组织的持续衰老。

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