异氟烷/丙泊酚配伍对低氧损伤大鼠海马神经元BiP-GABAA受体α1亚基稳态的影响

摘要

目的：神经元细胞在缺氧条件下易受损伤及发生功能障碍。在缺血性脑病患者中，认知功能障碍非常普遍。对于术前已存在认知功能减退的患者若麻醉药物选择不当将加重病情。异氟烷可引发神经元损伤，其神经毒性作用具有剂量依赖性。而亚麻醉剂量（20mg·kg-1·h-1）丙泊酚通过激活KCC2-GABAA受体（GABAAR）通路发挥脑保护作用。麻醉药物配伍应用可降低单一用药剂量，减少单一用药诱发的不良反应。两者配伍麻醉对该类患者认知功能的影响有待研究。因此，我们培养大鼠海马神经元，建立低氧损伤模型，以模拟缺氧损伤引起认知功能障碍的过程。研究异氟烷及丙泊酚不同配伍对大鼠海马神经元低氧损伤的影响及其可能机制。 方法：研究分两部分。第一部分，探究异氟烷与丙泊酚不同剂量配伍对低氧损伤大鼠海马神经元活力、GABAARα1亚基稳态、内质网应激水平的影响。原代培养Wistar大鼠胎鼠海马神经元，采用随机数字表将神经元分为6组(n=12):正常对照组（C组）、低氧损伤组（H组）、异氟烷-丙泊酚不同配伍组（IP1组和IP2组）、异氟烷组（I组）、丙泊酚组（P组）。C组正常培养；H组低氧培养3h；I组和P组低氧培养3h后分别经1.9%异氟烷和22.4μmol/L（即4μg/ml）丙泊酚孵育3h；IP1组和IP2组低氧培养3h后分别经1.0%异氟烷+6.7μmol/L（即1.2μg/ml）丙泊酚、1.4%异氟烷+3.4μmol/L（即0.6μg/ml）丙泊酚孵育3h；随后更换正常培养基培养。培养24h时采用CCK-8法检测细胞活力，使用qRT-PCR法检测GABAARα1亚基mRNA的表达，采用Western blot法检测胞膜GABAARα1亚基、BiP蛋白的表达及Caspase12活化水平，采用免疫沉淀和Western blot法检测GABAARα1亚基ERAD水平，采用Western blot法和免疫荧光检测C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）表达。第二部分，探究BiP在异氟烷与丙泊酚配伍对大鼠海马神经元GABAARα1亚基稳态调控中的作用。使用随机数字表法将原代大鼠海马神经元分为6组(n=12)：阴性转染组（Con-siRNA+C组）；阴性转染组+低氧损伤组（Con-siRNA+H）；1％异氟烷+6.7μmol/L丙泊酚处理的低氧损伤阴性转染细胞组（Con-siRNA+IP1组）；BiP-siRNA转染组（BiP-siRNA+C组）；BiP-siRNA转染+低氧损伤组（BiP-siRNA+H组）；1％异氟烷+6.7μmol/L丙泊酚处理的低氧BiP-siRNA转染组（BiP-siRNA+IP1组）。使用相应药物孵育后，采用CCK-8法检测细胞活力，使用qRT-PCR法检测GABAARα1亚基mRNA的表达，采用Western blot法检测胞膜GABAARα1亚基及Caspase12活化水平，采用免疫沉淀和Western blot法检测GABAARα1亚基ERAD水平，采用Western blot法和免疫荧光检测CHOP蛋白表达。 结果：第一部分实验结果：与C组比较，其余5组神经元活力降低，GABAARα1亚基mRNA和胞膜GABAARα1蛋白表达下调，ERAD水平升高，BiP和CHOP表达上调，Caspase12活化增加（P＜0.05）。与H组比较，I组、P组和IP2组神经元活力降低，GABAARα1亚基mRNA和胞膜GABAARα1蛋白表达下调，ERAD水平升高，CHOP表达上调，Caspase12活化增加（P＜0.05），IP1组上述指标差异无明显改变,但BiP表达显著升高（P＜0.05）；与I组或P组相比，IP1组和IP2组神经元活力升高，GABAARα1亚基mRNA和胞膜GABAARα1蛋白表达上调，ERAD水平降低，CHOP表达下调，Caspase12活化降低，但BiP表达升高（P＜0.05）。与IP1组比较，IP2组神经元活力降低，GABAARα1亚基mRNA和胞膜GABAARα1蛋白表达下调，ERAD水平升高，BiP表达下调，CHOP表达上调，Caspase12活化增加（P＜0.05）。第二部分实验结果：与Con-siRNA+C组相比，BiP-siRNA+C组的神经元活力，GABAARα1亚基mRNA、胞膜GABAARα1蛋白表达和ERAD水平、CHOP表达和Caspase12活化水平均无明显改变。与Con-siRNA+H组相比，BiP-siRNA+H组的神经元活力降低，GABAARα1亚基mRNA、胞膜GABAARα1亚基表达下调，ERAD水平升高，CHOP表达上调，Caspase12活化增加（P＜0.05）。与Con-siRNA+IP1组或BiP-siRNA+H相比，BiP-siRNA+IP1组的神经元活力降低，GABAARα1亚基mRNA、胞膜GABAARα1亚基表达下调，ERAD水平升高，CHOP表达上调，Caspase12活化增加（P＜0.05）。 结论：异氟烷与丙泊酚配伍应用，特别是1%异氟烷与6.7μmol/L丙泊酚配伍，通过BiP-GABAARα1途径，减轻内质网应激，维持GABAARα1亚基的稳态，进而维持神经元活力。

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