胺基聚甲基丙烯酸甘油酯季铵盐的合成及其作为基因载体的性能和抗菌活性研究

摘要

近年来，支化和超支化大分子引起人们越来越多的关注，主要是因为它具有比较固定的结构以及多价态组分比例较高，使得这些具有纳米尺寸的材料有望作为非病毒载体。
　　 线性和八臂胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGOHMAs)由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)与异丙胺(MEA)，二乙胺(DEA)，二正丙胺(DPA)通过开环反应生成。对其所含的叔胺用碘甲烷通过季铵化反应进行修饰，生成季铵盐，简称QPGMAs，QPGMA与pDNA（质粒）在不同的N/P摩尔比例条件下形成纳米粒子。此外，异丙胺修饰的八臂PGMA与pDNA形成的纳米粒子作为阳性对照。扫描电镜显示QPGMA/pDNA复合物呈球形，动态光散射测出其粒径比S8-MEA/pDNA要更小，同时，凝胶电泳阻滞实验与EB置换实验显示QPGMA/pDNA可以在更低的N/P有条件下压缩DNA，用Huh-7cells做体外实验发现:与S8-MEA/pDNA复合物相比，QPGMA/pDNA复合物细胞毒性低和转染效率高。细胞摄取实验结果显示QPGMA可以提高DNA的摄取，尽管QPGMA/pDNA在溶酶体中的逃逸效率略低于S8-MEA/pDNA，但是，总的来说，将胺基PGOHMA季铵化形成的季铵盐可以作为有效地基因传递载体。
　　 采用核磁、红外、GPC、热重以及溶解度测试对QPGMAs的物化性质及结构进行表征，胺基PGOHMA的胺基取代率由元素分析结果计算所得，季铵盐的季铵化度(DQ)由X射线光电子能谱分析(XPS)测得，根据溶解度结果所得，S8-MEA是唯一的一种水的胺基PHOHMA，因此，用它作为QPGMA的抗菌对照。这些PGMA衍生物的抗菌活性是通过最低抑菌浓度(MIC)和抑菌率(BIR)来衡量的，测试菌种为大肠杆菌（Escherichiacoli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），结果显示，QPGMAs比S8-MEA的抗菌活性强，且在弱碱性条件下，随着DQ的增加，抗菌活性增强，此外，研究发现化学结构与pH都会影响抗菌活性。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 基因治疗概述

1．2 非病毒基因载体-物理方法

1．2．1 注射裸DNA

1．2．2 电穿孔(Electroporation)

1．2．3 基因枪(Gene gun)

1．2．4 超声介导法(Ultrasound)

1．3 非病毒载体-化学方法

1．3．1 脂质体

1．3．2 聚L-赖氨酸(PLL)

1．3．3 聚乙烯亚胺(PEI)

1．3．4 树状高分子

1．3．5 壳聚糖

1．3．6 阳离子聚合物基因载体功能化修饰

1．4 高分子抗菌材料

1．4．1 含氮季铵盐高分子

1．4．2 含胍类高分子

1．4．3 卤代胺类高分子

1．4．4 含磷酸基和苯磺酸基高分子

1．4．5 化学改性的抗菌高分子

1．4．6 含有机抗菌组分的高分子

1．5 课题来源及选题依据

第二章 胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯及其季铵盐的合成

2．1 实验仪器及试剂

2．1．1 实验仪器与主要设备

2．1．2 材料与试剂

2．2 胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯及其季铵盐的合成与表征

2．2．1 胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯及其季铵盐的合成

2．2．2 产物的表征

2．2．3 胺基含量的测定

2．3 结果与讨论

2．4 结论

第三章 胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯季铵盐作为基因载体性能的研究

3．1 实验仪器与试剂

3．1．1 实验仪器与主要设备

3．1．2 材料与主要试剂

3．2 质粒PEGFP-N1的准备

3．2．1 感受态细胞的制备

3．2．2 质粒PEGFP-N1的转化

3．2．3 质粒PEGFP-N1的扩增、提取与鉴定

3．2．4 质粒DNA浓度的测定

3．3 高分子与质粒DNA复合物的制备

3．4 复合物的表征

3．4．1 动态光散射(DLS)

3．4．2 溴化乙锭(EB)置换实验

3．4．3 凝胶电泳阻滞实验

3．4．4 扫描电镜(SEM)

3．4．5 细胞毒性试验

3．4．6 体外转染实验

3．4．7 流式细胞仪分析

3．4．8 细胞摄取实验

3．5 结果与讨论

3．5．1 粒径与电势

3．5．2 溴化乙锭置换实验

3．5．3 扫描电镜

3．5．4 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验

3．5．5 复合物的细胞毒性实验与转染实验

3．5．6 细胞摄取实验

3．5．7 CLSM和溶酶体逃逸效率

3．6 结论

第四章 胺基聚甲基丙烯酸缩水甘油酯季铵盐抗菌性能的研究

4．1 实验仪器与试剂

4．1．1 实验仪器与主要设备

4．1．2 材料与试剂

4．2 产物的表征

4．3 胺基PGOHMA与QPGMA溶解度测试

4．4 热重分析(TGA)

4．5 抗菌活性的研究

4．5．1 细菌的形态和细胞结构

4．5．2 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的化学结构和组成

4．5．3 培养基的配制

4．5．4 抑菌环实验

4．5．5 最低抑菌浓度(MIC)测定

4．5．6 抑菌率的测定

4．6 结果与讨论

4．6．1 胺基PGOHMA与QPGMA溶解度测试

4．6．2 热重分析(TGA)

4．6．3 抑菌环实验

4．6．4 最低抑菌浓度和抑菌率

4．7 结论

第五章 结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢