聚乙二醇修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的初步研究

摘要

由于血液的需求量迅速增长,而天然血液的来源不足,而且病毒污染严重,开发具有携氧能力的人工红细胞代用品成为国际关注的研究热点.采用聚乙二醇修饰牛血红蛋白,能够延长血红蛋白在体内的半衰期,减少肾毒性,降低牛血红蛋白的免疫原性,并且原料来源广泛,是一种很有潜力的红细胞代用品. 本文在对聚乙二醇修饰牛血红蛋白的研究主要分为四个部分: 首先,本论文考察了不同条件下,SC-mPEG与血红蛋白的反应的产率,并且建立了分析PEG-bHb混合物的方法.根据不同反应因素对PEG修饰血红蛋白反应的影响确定了SC-mPEG与血红蛋白反应的最佳体系即SC-mPEG与血红蛋白最佳配比为60:1,在4℃,pH9的缓冲溶液体系反应2小时. 第二,本实验采用了阳离子交换层析法和有机溶剂分离纯化两种方法来分离PEG-bHb和未修饰血红蛋白.前者根据血红蛋白表面所带电荷量的不同分离.而对于PEG化Hb的混合物,进样之后,被修饰的Hb组分直接以一个尖峰的形式流出层析柱；未修饰的Hb组分被吸附,需用盐溶液洗脱下来.由此,残留的未修饰Hb和被修饰的Hb在阳离子交换层析中得到了分离.后者根据蛋白质在有机溶剂中析出的原理将未反应Hb与PEG-bHb分离.后者方法相对操作简单. 第三,本实验采用SDS-PAGE和TNBS法对反应产物和分离产物分别进行了检测和鉴定,结果互相符合. 第四,SC-mPEG和马来酰亚胺-PEG与血红蛋白反应的部分对比实验. 本文工作主要建立了聚乙二醇修饰牛血红蛋白的研究路线和分析方法,为进一步改善产物性质创造条件.并对在低比例条件下,PEG修饰血红蛋白的产物中含有一定量的未被交联PEG的血红蛋白,为了避免这些未修饰的血红蛋白进入人体引发肾毒性和免疫反应,对反应产物进行适当的分离纯化.

目录

文摘

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第一章 0文献综述

1.1前言

1.2血液代用品的研究

1.2.1各种血液代用品的研究

1.2.2血液代用品的临床研究状况

1.3 PEG修饰蛋白质概述

1.3.1第一代PEG的活化

1.3.2第二代PEG的活化

1.4 PEG修饰蛋白质的分离纯化

1.4.1利用溶解度不同的纯化方法

1.4.2有机溶剂分离纯化方法

1.4.3亲和层析

1.4.4离子交换层析

1.4.5凝胶过滤层析

1.5研究内容和意义

第二章聚乙二醇修饰剂的合成

2.1引言

2.1.1以氨基为修饰目标

2.1.2以巯基为修饰目标

2.2材料和方法

2.2.1材料

2.2.3实验方法

2.2.4 SC-mPEG的检测

2.3结果与讨论

第三章SC-mPEG修饰牛血红蛋白的条件优化和检测

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与讨论

3.3.1不同条件下的SDS-PAGE图

3.3.2 TNBS检测平均修饰度

3.4小结

第四章SC-mPEG修饰牛血红蛋白产物的分离纯化和检测

4.1引言

4.1.1分离纯化PEG化血红蛋白的必要性

4.1.2 PEG化血红蛋白分离纯化的策略

4.1.3 PEG化血红蛋白分离纯化方法的原理

4.2材料和方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与讨论

4.3.1阳离子交换层析分离PEG-bHb混合物图谱

4.3.2阳离子交换层析分离产物的检测

4.3.3有机溶剂沉淀法分离产物的检测

第五章PEG-马来酰亚胺修饰牛血红蛋白的初步检测

5.1引言

5.2材料和方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果与讨论

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

致 谢

附录1 SC-mPEG的NMR图