用进化工程方法进行虾青素高产株的选育

摘要

虾青素是一种高附加值的酮式类胡萝卜素，具有极强的淬灭活性氧和清除氧自由基的能力，在食品、医药、养殖业等方面有广阔的应用前景。利用红法夫酵母生产虾青素，具有发酵周期短，易于实现高密度培养等特点而受到广泛关注。本文利用进化工程的方法对红法夫酵母进行育种，筛选高产菌株。
　　 本文利用红法夫酵母野生菌株As2.1557经过两轮基因组重排得到的产虾青素高产株F2-11作为出发菌株，经过紫外线和亚硝基胍复合诱变，构建出用于进化培养的多性状亲本库，同时研究了各种产生活性氧的物质对菌群的抑制情况，确定了用于进化培养的筛选压力。分别为：NaClO：0.2％；H2O2：0.1％：MB：10-5mol/L：TiO2：300mg/L。通过实验计算了所选菌株的代时为5.34h。将经过复合诱变后的亲本库置于装有液体发酵培养基的摇瓶中培养，培养条件为：接种量为10％，摇床转速为150 rpm，培养温度22℃。培养至对数期添加各种抑制剂，进入进化培养阶段，连续培养30代。随后研究了诱变菌群对环境适应性和虾青素含量及产量的问题。与出发菌株相比，经过进化培养的菌株显示出较强的适应性，虾青素含量和产量也有明显增加。经涂布平板，挑出体积较大、颜色较红的菌落，置于96孔细胞培养板中培养，进行虾青素高产株的筛选。测定其产量，选出最高的一株TiO2-17，产量达到1.98mg/L。比出发菌株F2-11(1.83mg/L)提高8.4％。
　　 论文还探索了利用RGB颜色传感器，快速检测菌落中色素含量的方法。拟合出虾青素含量与R、G、B三个变量之间的关系方程。在此基础上初步确定了一种用于红法夫酵母虾青素快速检测筛选菌株的方法。
　　 对经过进化培养筛选出的红法夫酵母产虾青素高产株，进行了5L发酵罐的放大培养实验，根据实验的结果，分别构建了红法夫酵母生长动力学模型、虾青素的合成动力学模型和底物的消耗动力学模型。同时拟合了模型中的参数，并将根据模型的预测结果与实验的结果进行了对比。吻合度较好，较好的反映了发酵过程的规律，可以用来表示该菌株的发酵动力学。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1虾青素

1.1.1虾青素虾青素的结构与理化性质

1.1.2虾青素的功能与应用

1.1.3虾青素的生产方法和市场现状

1.2虾青素的生物合成

1.2.1红法夫酵母

1.2.2雨生红球藻

1.2.3虾青素的合成途径

1.2.4活性氧对虾青素合成的影响

1.2.5红法夫酵母虾青素高产株的选育

1.3进化工程

1.3.1进化工程的原理与方法

1.3.2进化工程的应用进展

1.4本课题主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1出发菌种

2.1.2培养基

2.1.3溶液与试剂

2.1.4仪器与设备

2.2培养方法

2.2.1菌种活化

2.2.2种子培养

2.2.3摇瓶发酵培养

2.2.4发酵罐培养

2.3分析方法

2.3.1分光光度法测定虾青素

2.3.2生物量的测定

2.3.3残糖的测定

2.4诱变方法

2.4.1紫外诱变

2.4.2亚硝基胍诱变

2.4.3复合诱变

2.4.4.原生质体融合

2.5进化过程

2.5.1.红法夫酵母代时的确定

2.5.2筛选压力的确定

2.5.3红法夫酵母的进化培养

2.6高产株的筛选方法

2.6.1用96孔板筛选虾青素高产株

2.6.2 RGB颜色传感器测定虾青素含量

第三章 结果与讨论

3.1红法夫酵母野生菌株与出发菌株生长曲线的比较

3.2红法夫酵母代时的确定

3.3诱变

3.3.1紫外诱变条件的优化

3.3.2 NTG诱变条件的优化

3.3.3复合诱变过程

3.4进化筛选压力的确定

3.4.1 NaClO浓度的确定

3.4.2 H2O2浓度的确定

3.4.3 MB浓度的确定

3.4.4 TiO2浓度的确定

3.5选择压力下的进化培养

3.5.1进化过程中种群适应性的变化

3.5.2进化过程中虾青素产量与含量的变化

3.5.3红法夫酵母虾青素高产株的筛选

3.6进化工程菌的发酵动力学的研究

3.6.1红法夫酵母生长动力学

3.6.2虾青素的合成动力学

3.6.3底物的消耗动力学

3.6.4利用5L发酵罐对进化株进行培养

3.6.5红法夫酵母生长动力学模型的构建

3.6.6虾青素生成的动力学模型的构建

3.6.7底物消耗动力学模型的构建

第四章 结论与展望

4.1主要结论

4.2创新点

4.3展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢