EGCG作为一种有效的STAT3信号传导通路抑制剂的研究

摘要

原发性肝癌是几种最为常见的恶性肿瘤之一,其患者有较低的生存率。信号传导转录激活因子3(STAT3)是一种新被发现的致癌基因,它能够促进肝癌细胞的生长,繁殖,死亡和进展。在本研究中,我们从多种角度探究了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为一种潜在的STAT3抑制剂的应用和相关机理。此前的一些研究也已表明EGCG是一种广谱的抗癌化合物。有相关报道其能够阻滞几种细胞因子的活化,从而阻断多种下游信号转导通路如STAT3/JAK信号通路。
　　当应用药物干预BEL-7402和QGY-7701细胞模型后,我们应用MTT体外实验证明了EGCG能够强烈的抑制这两种细胞系的增值和迁移。EGCG能够诱导体外肝癌细胞呈现一个很明显的浓度依赖性抑制效果。两者的半数抑制剂浓度(IC50)分别为:BEL-7402细胞系大约为55μM,QGY-7704细胞系大约为35μM。我们还应用流式细胞仪技术证明了EGCG能够通过干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞发生凋亡。用20μM,40μM,80μMand160μM干预BEL-7402细胞24小时后凋亡率分别为4.4％,6.7%,8.5%和35.6%。相同的条件下,QGY-7704细胞24小时后凋亡率分别为9.1%,15.3%,22.7%和50.6%(P<0.05)。这些结果证明了QGY-7704对于EGCG的干预作用相比于BEL-7402细胞更为敏感。同时,EGCG能够明显降低磷酸化STAT3的表达量,但是对于总STAT3表达量影响不是很明显。RT-PCR的结果证明EGCG能够下调STAT3调控基因表达,从而有效抑制肝癌细胞迁移,入侵和增值。
　　再者,我们应用分子对接的方式阐释了STAT3和EGCG的相互作用。EGCG中的-C=O作为氢的受体同时与GLU612中的-NH以及SER613中的-OH形成氢键,这种结构也形成了较为牢固的相互作用;EGCG中的一个芳环上的氢与STAT3中ARG609中的一个-HH2还形成一般的氢键。除此之外,EGCG的其余部分主要以范德华力与STAT3的疏水袋(LYS591、GLU594、ARG609、SER611、GLU612、SER613、THR620、VAL637、GLU638、PRO639)产生相互作用。这些结果和PT-PCR的结果一样,证明了EGCG能够从分子水平上阻滞STAT3活化。总之,我们通过我们一系列实验证明了EGCG能够通过干预STAT3信号通路抑制HCC细胞的生长,入侵和迁移,并且诱导肝癌细胞的凋亡。

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第一章 新型抗癌药物分子靶标STAT3和EGCG临床研究进展

1.1 新型抗癌药物分子靶标STAT3研究进展

1.1.1 STATS蛋白家族生理机制简介

1.1.2 STAT3 和肿瘤形成

1.1.3 STAT3 作为一种新的抗癌药物新靶点

1.1.4以STAT3为靶点的药物开发策略

1.2 EGCG临床应用研究进展

1.2.1 针对EGCG抗肿瘤活性机理的临床研究

1.2.2 EGCG抑制肝癌细胞生长的机理研究进展

1.3课题意义

第二章 EGCG作为一种STAT3抑制剂的研究

2.1实验材料与仪器

2.1.1实验材料

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 人类肝癌细胞系BEL-7402和QGY-7704的培养

2.2.2 试剂的配制

2.2.3 实验分组

2.2.4 MTT法测定不同浓度EGCG对BEL-7402细胞增殖的影响

2.2.5流式细胞仪检测不同浓度 EGCG 对 BEL-7402 细胞和QGY-7704细胞凋亡的影响

2.2.6 酶联免疫吸附试验 （ ELISA ） 检测不同浓度下的 EGCG 对BEL-7402 细胞和QGY-7704细胞内 Stat3及 P-Stat3 含量的影响

2.2.7 RT-PCR测定EGCG干预后细胞内mRNA水平变化

2.2.8 Western blotting法测定STAT3信号通路蛋白水平变化

2.2.9 Molecule DOCKING 法模拟EGCG与STAT3之间相互作用

2.2.10 数据处理

第三章 结果与讨论

3.1光学显微镜下EGCG作用过后的细胞形态学观察

3.2不同浓度的EGCG对BEL-7402细胞和QGY-7704细胞增殖、凋亡的影响

3.2.1不同浓度的EGCG 对BEL-7402细胞增值的影响

3.2.2 EGCG对肝癌细胞凋亡的影响

3.3 EGCG对肝癌细胞中Stat3和P-Stat3表达的影响

3.4 EGCG对肝癌细胞中Stat3信号通路下游基因的调控

3.5 DOCKING 模拟Stat3与EGCG间的相互作用

3.6讨论

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢