山羊关节炎脑炎病毒编码蛋白逃逸先天性免疫的分子机制

摘要

山羊关节炎脑炎是由山羊关节炎脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV）引起的慢性进行性传染病，严重威胁养羊业发展。慢性感染，终身带毒，多组织炎症是该病的主要特征。抗病毒先天免疫反应是宿主防御系统的重要组成部分，通过早期感知病毒的入侵并快速启动防御机制来抑制病毒感染。干扰素β（Interferonβ,IFN-β）是评价先天免疫反应的重要标志分子，具有广谱的抗病毒和免疫调节作用。CAEV感染机体对IFN-β的影响还不清楚。为了解CAEV感染对宿主细胞先天性免疫的影响，本文分析了6种CAEV基因编码蛋白在细胞中的作用，研究了它们在IFN-β产生过程中的分子机制，为认识CAEV的致病及免疫机理提供依据。主要结果如下： （1）不同CAEV编码蛋白对细胞IFN-β转录表达的影响：病毒编码蛋白在病毒感染调节中具有重要作用，本研究选取了参与CAEV增殖调节的蛋白酶RVP、dUTP酶DU、利于病毒RNA合成的蛋白Tat、促进病毒基因组整合的蛋白IN、调节蛋白Vif及主要抗原蛋白P25，分别构建了其真核表达载体并转染293T细胞，接种SeV或VSV病毒，检测不同病毒编码蛋白对IFN-β产生的影响，通过qRT-PCR、荧光显微镜检测SeV、VSV-GFP的增殖情况。结果表明，DU和Vif可以抑制IFN-β转录及表达，促进病毒SeV、VSV的增殖，其他蛋白对IFN-β的表达无显著影响。 （2）DU和Vif对抑制IFN-β产生信号通路的影响：应用qRT-PCR和荧光素酶报告系统，研究了DU和Vif对IFN-β及其调控转录因子产生的影响。应用RIG-I/MDA5/MAVS/TBK1质粒转染细胞激活IFN-β途径，通过检测由ISRE、和NF-κB2种不同转录因子控制下的荧光酶活性表征IFN-β产生情况，结果显示，过表达DU和Vif可抑制由ISRE、NF-κB和IFN-β启动子控制下的荧光酶活性；但过表达DU或Vif蛋白，并不影响IRF3活化的IFN-β启动子调控下的荧光酶活性，这表明，DU和Vif是通过负调控IRF3上游信号转导分子的活性，抑制IFN-β信号通路的激活。缺失Vif蛋白149-164位氨基酸，其对IFN-β的抑制作用明显减弱，表明该区段氨基酸序列，对抑制IFN-β产生、促进CAEV感染具有重要作用。 综上，本文发现CAEV基因编码的DU和Vif蛋白，可通过下调ISRE和NF-κB控制的IFN-β的转录，抑制IFN-β的产生，其抑制IFN-β信号通路位于IRF3上游。我们的结果表明，CAEV可通过其编码的DU和Vif蛋白，下调IFN-β的产生从而逃逸宿主细胞先天免疫反应，促进病毒的增殖。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 CAEV概述

1.1.1 分类地位

1.1.2 分子生物学研究

1.1.3 生物学周期简述

1.1.4 致病机理

1.1.5 流行病学特点及临床特征

1.1.6 诊断与防治

1.2 CAEV 感染的免疫反应

1.2.1 CAEV 引起的先天免疫应答

1.2.2 CAEV 引起的适应性免疫应答

1.3 I 型IFN 概述

1.3.1产生IFN-β信号通路介绍

1.3.2 Ⅰ型IFN信号传导和ISG的诱导

1.4 研究目的及意义

第2章 不同CAEV蛋白对IFN-β 产生的调节作用

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体

2.2.2 主要试剂

2.2.3 实验仪器设备

2.3 实验方法

2.3.1 基因克隆

2.3.2 载体构建及验证

2.3.3 细胞转染及接毒（以12孔板为例）

2.3.4 真核载体表达验证

2.3.5 总RNA 提取及cDNA 合成

2.3.6 相对荧光定量PCR 检测

2.3.7 荧光素酶活性检测

2.4 实验结果与分析

2.4.1 CAEV基因扩增

2.4.2 真核表达载体构建及验证

2.4.3过表达病毒蛋白对SeV 复制的影响

2.4.4病毒蛋白对IFN-β的影响

2.5 讨论

2.5.1 CAEV蛋白对SeV增殖的影响

2.5.2 CAEV蛋白对IFN-β的影响

2.6 本章小结

第3章 DU影响 IFN-β 产生的分子机制

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体

3.2.2 主要试剂

3.3 实验方法

3.3.1 基因克隆

3.3.2 载体构建及验证

3.3.3 相对荧光定量PCR检测

3.4 实验结果与分析

3.4.1 DU 对IFN-β 的抑制作用不受标签蛋白的影响

3.4.2 DU 促进SeV 和VSV 复制

3.4.3 DU剂量依赖性的抑制IFN-β的表达

3.4.4 DU在IFN-β产生的信号通路上的作用

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章 CAEV蛋白Vif 对IFN-β转录表达的影响

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体

4.2.2 主要试剂

4.3 实验方法

4.3.1 基因克隆

4.3.2 载体构建及验证

4.4 实验结果与分析

4.4.1 Vif 抑制IFN-β 信号通路

4.4.2 Vif抑制的信号通路中位于IRF3上游的信号分子

4.4.3 Vif 中有关键结构域影响其抑制IFN-β的功能

4.5讨论

4.6本章小结

结论

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢