利用B基因的过表达或敲除来改变番茄果实中类胡萝卜素的组成和含量

摘要

番茄红素和β胡萝卜素是两种重要的类胡萝卜素,它们不但在高等植物生长发育中起重要的作用,而且对人体健康和营养也非常重要.有报道显示它们能有效治疗多种慢性疾病,而且大量的摄取还可以降低多种癌症的发病率.改进农作物中类胡萝卜素含量和组成,以提高农作物的营养价值成为近年的研究热点.番茄果实及其制品是人类摄取番茄红素的主要来源,也是β胡萝卜素的重要来源.因此,该课题致力于利用基因工程技术改进番茄中番茄红素和β胡萝卜素的含量,从而分别获得富含番茄红素和β胡萝卜素的优质番茄.番茄红素β-环化酶是番茄果实类胡萝卜素合成途径中最后的限速酶,它催化番茄红素转化为β胡萝卜素.当番茄红素β-环化酶过表达时,番茄中会积累β胡萝卜素;而当番茄红素β-环化酶表达被抑制时,番茄中会积累番茄红素.番茄中番茄红素β-环化酶是一个多基因家族,现已发现两种编码番茄红素β-环化酶的基因,CRTL-B和B.由B基因编码的有色体特异性的番茄红素β-环化酶在番茄花和果实中特异性表达.为提高番茄果实中β胡萝卜素的含量,作者根据GenBank报道的核酸序列信息设计特异性引物,通过PCR方法,从微型番茄Micro-Tom核基因组DNA中克隆到了B基因的编码区,将B基因与植物组成型表达CaMV35S启动子融合,构建成双元载体pLeBZN,导入农杆菌,利用农杆菌介导的遗传转化方法转化到微型番茄Micro-Tom中,现通过抗性筛选和PCR鉴定,已经筛选出一些转基因植株.转基因植株的花和成熟果实中β胡萝卜素和番茄红素含量有待于进一步检测,同时,还有许多假定的转基因番茄有待于进一步的筛选和鉴定.另一方面,为了利用RNA干扰技术敲除番茄中的B基因以提高番茄果实中番茄红素的积累,作者从B基因组中克隆了327bp的DNA片段,分别正向和反向插入RNAi表达载体pKANNIBAL的克隆位点,并进一步构建B基因的双链RNAi表达载体LeRNAiZN以进行微型番茄的转化,这部分实验正在进行当中.

目录

文摘

英文文摘

前言

一、类胡萝卜素的生物学特点

二、类胡萝卜素的生物合成途径

三、β胡萝卜素和番茄红素的化学特性及生理功能

四、利用基因工程技术提高植物中番茄红素和β胡萝卜素含量的研究进展

五、番茄红素β环化酶

六、植物转基因技术

七、RNAi技术

八、课题意义

实验材料与方法

一、实验材料

1.植物材料

2.质粒与菌株

二、实验方法

1.目的基因的获得

2.双元载体的构建

3.农杆菌的转化及阳性克隆的筛选和鉴定

4.Micro-Tom的转化和转基因植株的筛选和检测

实验结果

1.组成型表达B基因的双元载体pLeBZN的构建

1.1目的基因的PCR扩增

1.2 PCR产物的T/A克隆

1.3重组质粒的酶切和PCR鉴定

1.4组成型表达B基因的双元载体pLeBZN的构建及阳性菌株的筛选和鉴定

1.5序列测定与比较分析

2.B基因的双链RNAi表达载体pLeRNAiZN的构建

2.1目的基因的PCR扩增

2.2 PCR产物的T/A克隆

2.3重组质粒的酶切和PCR鉴定

2.4 RNAi表达载体pLeRNAiZN的构建

3.pLeBZN的农杆菌转化，阳性克隆的筛选和鉴定

4.Micro-Tom的转化和转基因植株的筛选和检测

4.1 Micro-Tom的转化（如图16）

4.2转化植株的检测

讨论

前景与展望

参考文献

在读期间发表论文

致谢