微生物中具有选择性拆分获得（S）-Ketoprofen能力的脂肪酶的研究

摘要

该文以自筛选出的具有一定不对称转化生成(S)-酮基布洛芬能力的芽孢杆菌为材料,对此菌株的培养条件,全细胞体系的转化条件以及该菌株细胞中脂肪酶的分布、性质、分离纯化后不对称转化能力的变化等方面进行了研究.实验结果表明,利用疏水层析柱-凝胶过滤层析柱分离纯化该菌细胞中的脂肪酶,活性峰酶的比活提高了61.7倍;其中23kDa蛋白纯度提高400倍以上.结果说明此层析技术对从细菌细胞直接提取的粗酶中,获得较难分离的低丰度脂肪酶来说是一种快速、实用而有效的纯化手段.纯化后的脂肪酶以乙酸对硝基苯酯和酮基布洛芬氯乙酯为底物表现出与全细胞体系相一致的脂肪酶水解活性.在构建的PBS-溶菌酶-石英砂提取转化体系中,24、48、72小时粗酶的转化率相差不大,但24小时的(S)-对映体过量最高,达到6.18﹪.疏水层析后酶活高峰合并组分各时间段转化率也无明显差异,(S)-对映体过量仍以24小时最高,为18.9﹪.凝胶过滤后所得的酶活高峰各管尽管蛋白种类不同,但也都具有不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力.其中第15号管中经SDS-PAGE检测仅见23kDa的单一蛋白带,(S)-对映体过量高达52.0﹪.说明13号菌中具有不对称拆分能力的脂肪酶不止一种;此结果为揭示细菌中脂肪酶不对称拆分的本质具有非常重要的意义.利用ESI-QUAD-TOF质谱分析23kDa脂肪酶.在蛋白质数据库MSDB中比对质谱得到的肽序列标签,没有发现与23kDa蛋白匹配的已知蛋白.因此,可确定该实验获得的23kDa蛋白为一种未知蛋白.从其它数据库(Swiss-Prot/TrEMBL,PROSITE)搜索及分析也发现,肽序列标签中没有与已知脂肪酶或酯酶相同的序列;而且也未在其中发现芽孢杆菌脂肪酶的保守序列Gly/Ala-X<,1>-Ser-X<,2>-Gly.考虑到质谱分析所得肽序列标签只是蛋白全序列的一部分,因此,估计保守序列在未被分析的氨基酸序列之中.13号菌中23kDa脂肪酶质谱分析的结果,为最终构建具有特异性拆分2-芳基丙酸类药物能力的工程菌奠定了基础.

目录

前言

1手性药物概述

1.1手性

1.2手性药物

1.3单一对映体手性药物的开发

2单一对映体手性化合物的制备

3 2-芳基丙酸类药物

4脂肪酶概述

4.1脂肪酶

4.2脂肪酶的种类

4.3脂肪酶的性质

4.4脂肪酶催化反应体系

4.5脂肪酶的应用

5研究目的与意义

实验材料与方法

1实验材料

1.1菌种（NK13号）

1.2试剂

1.3实验仪器

2实验方法

2.1革兰氏染色：

2.2芽胞染色：

2.3菌体培养：

2.4脂肪酶活性测定-采用乙酸对硝基苯酯法：

2.5 PBS全细胞转化体系的建立及底物转化检测：

2.6粗酶提取：

2.7疏水层析纯化脂肪酶：

2.8电导测定异丙醇浓度：

2.9考马斯亮蓝染料结合法测蛋白含量：

2.10 SDS-PAGE电泳：

2.11银染：

2.12酶液的透析：

2.13凝胶过滤纯化脂肪酶：

2.14酶液转化体系的构建：

2.15 ESI-QUAD-TOF质谱分析：

实验结果

1 NK13号菌的初步鉴定和培养条件的优化

1.1 NK13号菌的鉴定

1.2 NK13号菌培养条件的优化

2 13号菌中脂肪酶的分布和PBS提取体系对酶转化的影响

2.1 13号菌中脂肪酶胞内外分布的测定

2.2不同浓度PBS提取13号菌中脂肪酶对转化酮基布洛芬氯乙酯的影响

3 13号菌粗提酶的分离纯化

3.1 NK13号菌粗酶的Phenyl Sepharose CL-4B柱层析

3.2 SDS-PAGE电泳检测结果

3.3疏水层析前后酶活力分析

3.4疏水层析前后酶液转化结果

4 Sephacryl S-200凝胶柱进一步纯化脂肪酶

4.1凝胶过滤层析分离纯化疏水层析获得的活性组分

4.2 SDS-PAGE电泳检测结果

4.3凝胶过滤层析所得酶活高峰组分活力分析

4.4 23kDa蛋白含量分析

4.5凝胶过滤层析所得酶活高峰组分的转化结果

5 ESI-QUAD-TOF质谱分析23kDa脂肪酶

讨论

1影响微生物产出脂肪酶的因素

2有机溶剂对脂肪酶活性及立体选择性的影响

3疏水层析适用于脂肪酶的纯化浓缩

4影响疏水层析洗脱的主要因素

5凝胶过滤层析分析

6凝胶过滤后酶活结果及各步转化结果的分析

7质谱分析

8工作展望

小结

参考文献

致谢