AHAS酶突变体系的建立及其研究

摘要

由于不断地向植物中是施加除草剂或是作用机理相同的除草剂的反复使用，导致杂草种群对除草剂产生了抗药性，给防治和生产管理增加了难度。从大量所研究的高等植物的抗性生物型中所得到的AHAS酶基因序列表明，一般来说，存在五个不连续的高度保留的抗性区域，这些区域中的氨基酸置换可能会产生抗性，这些突变使AHAS酶对除草剂的抑制作用不敏感。除了实验室的筛选外，所有杂草中建立在靶标基础上的对AHAS酶抑制剂的抗性都是由这五个保留区中任意某个基因突变所引起的。 为了找到杂草中建立在靶标AHAS酶基础上的对AHAS酶抑制剂的抗性根源，开发出新的农药体系克服杂草的抗药性，我们利用Megaprimer PCR基因定点突变技术，在E.coli AHAS Ⅱ酶的五个不连续高度保留区域A-E区中分别引入了W464A、W464F、W464L、W464Q、W464Y；M460A、M460F、M460L、M460Q、M460N；A108L、A108Q；V99L、V99Y；A26L、A26P、A26Q、A26Y基因点突变。通过PCR电泳分析、重组质粒的双酶切分析及测序鉴定，确证构建成功了十八个Ecoli AHAS Ⅱ酶突变体。通过对E.coli AHAS Ⅱ野生型及突变酶动力学性质的测定可以发现它们对于底物(pyruvate)及三种辅助因子(FAD、ThDP、Mg<'2+>)有着截然不同的特征常数，这些位点上氨基酸的突变很可能引起了AHAS酶局部构象的改变，构象上的改变导致了与三种辅助因子特征常数的上的差异。 此外，也通过E.coli AHAS Ⅱ野生型及突变酶对两种咪唑啉酮类除草剂和11种磺酰脲类除草剂敏感性的研究，比较不同的突变酶对于同种除草剂敏感性的差别。研究发现不同的突变体对不同结构的抑制剂敏感性是不一样的，对所测试的磺酰脲和咪唑啉酮除草剂都表现出抗性。这可能是由于除草剂结合在野生型的AHAS酶的底物进出的通道处，和这个通道上的氨基酸侧链形成了很强的相互作用，因为除草剂阻止了底物的进出，所以AHAS酶的活性就受到了抑制；但是如果这个通道处的某个氨基酸发生突变后，除草剂和这个通道上的氨基酸侧链形成的很强相互作用受到破坏，不能阻止底物的进出，AHAS酶的活性就不能受到抑制，因而对除草剂就表现出了抗性。 利用上述的抗性酶体系，研究这些抗性酶体系的分子作用机制，对于弄清楚农药的抗性，指导新农药的创制具有积极作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章实验部分

2.1实验的设计思想

2.2实验流程图

2.3实验材料

2.4实验方法

第三章实验结果与讨论

第四章总结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢