Sunitinib对Imatinib耐药K562细胞抗肿瘤作用及其机制研究

摘要

目的：通过研究多靶点酪氨酸激酶抑制剂Sunitinib对体外培养K562细胞，Imatinib耐药细胞株K562G和多药耐药细胞株K562A的抑制作用，以寻找克服Imatinib耐药的慢性粒细胞性白血病的新的靶向药物，并探讨其可能存在的分子机制。
　　 材料与方法：1．回顾性分析我科近5年收治的84例慢性粒细胞性白血病住院病人的基本情况。2.WST方法验证Imatinib耐药细胞株K562G及阿霉素诱导多药耐药细胞株K562A耐药诱导是否成功，计算耐药倍数，流式细胞仪检测Imatinib对细胞周期的影响。3.WST法检测Stmitinib对K562、K562G和K562A细胞活力的影响，流式细胞仪检测Sunitinib对细胞周期的影响。4．采用RT-PCR方法分析Sunitinib抗耐药CML细胞增殖可能存在的分子机制。
　　 结果：1．我科自2006年1月至2010年12月共收治84例确诊为慢性粒细胞性白血病的住院病人，处于慢性期59例(70.24％)、加速期14例(16.67%)及急变期11例(13.10%)，中位年龄为35岁，男/女为3.42/1；伴有肝牌肿大的患者约占86.90%，接受异基因造血干细胞移植的26例，其中亲缘供者20例，无关供者移植6例；其余患者接受药物治疗。2．Imatinib和阿霉素诱导的K562耐药细胞株，经验证Imatinib151maol/L不能抑制K562G细胞增殖，显示了大于30倍的耐药，K562A细胞显示了大于3倍的耐药。3．细胞增殖实验：不同稀释浓度药物与细胞共培养48h后，K562细胞组Sunitinib和Imatinib抑制细胞生长增殖的IC50分别为1.622+0.5542umol/L和0.5236+0.2266umol/L，两者相比具有显著性差异(P<0.05)；K562A细胞组Sunitinib和Imatinib抑制细胞生长增殖的IC50分别为1.208±0.26871umol/L和4.634±1.850unmol/L，两者相比具有显著性差异(P<0.05)；K562G细胞组Sunitinib和Imatinib抑制细胞生长增殖的IC50分别为13.33±1.11umol/L和113.363±4.835umol/L，两者相比具有显著性差异(P<0.05)。4．流式细胞仪检测结果：Sunitinib和Imatinib15umol/L与细胞共培养12h，K562细胞组S期细胞比例与对照组相比均无统计学差异，G2/M期细胞比例分别为31.76±3.78%和7，6±0.29%，具有显著性差异(P<0.05); K562A细胞组S期细胞比例分别为43.78±11.88%和62.01±3.204%，G2/M期细胞比例分别为32.71±7.25%和1.05±1.74%，均具有显著性差异(P<0.05)；K562G细胞组S期、G2/M期细胞比例与对照组相比均无统计学差异。Sunitinib和Imatinib15Iumol/L与细胞共培养24h，K562细胞组S期细胞比例分别为23.63±7.83%和35.35+8.111%，G2/M期细胞比例分别为42.62±1.91%和1.74+2.89%，均具有显著性差异(P<0.05)；K562A细胞组S期细胞比例分别为23.34±3.16%和54.57+0.752%，G2/M期细胞比例分别为37.23±3.73%和0.20±0.01%，均具有显著性差异( P<0.05)；K562G细胞组S期细胞比例分别为39.97±8.21%和72.29±1.104%，G2/M期细胞比例分别为46.56±3.40%和0.99±0.78%，均具有显著性差异(P<0.05)。Sunitinib可诱导细胞S期比例下调、G2/M期阻滞并具有一定的时间依赖性。5．RT-PCR结果：Sunitinib和Imatinib15umaol/L与细胞共培养12h，K562细胞组Caspase3相对表达量为0.6267±0.004和1.923±0.0645，Mcl-1相对表达量为0.1424+0.1056和0.4574+0.0573，均具有显著性差异(P<0.05)；K562A细胞组Caspase3相对表达量为1.246±0.0871和1.1233+0.0977，Mcl-1相对表达量为1.216±0.08992和0.8831±0.0728，均具有显著性差异(P<0.05): K562G细胞组Caspase3相对表达量为1.2160±0.0899和1.1574±0.1026，Mcl-1相对表达量为0.5729±0.0737和0.2548±0.0557，均具有显著性差异(P<0.05)。Sunitinib和Imatinib15 umol/L与细胞共培养24h，K562细胞组Caspase3相对表达量为0.7499±0.0420和0.8397±0.0274，Mcl-1相对表达量为0.3079±0.0787和0.5008±0.0343，均具有显著性差异(P<0.05); K562 A细胞组Caspase3相对表达量为0.9359±0.0394和0.30674±0.0170，Mcl-1相对表达量为0.2713±0.0511和0.3600-0.0173，均具有显著性差异(P<0.05)；K562G细胞组Caspase3相对表达量为1.9879±0.1640和0.8934±0.0816，Mcl-1相对表达量为0.2054±0.0309和0.54274±0.0953，均具有显著性差异(P<0.05)。Sunitinib诱导Caspase3mRNA相对表达量显著升高，激活了细胞凋亡路径，Mcl-1基因mRNA相对表达量显著下调，从而促进细胞凋亡。
　　 结论：Sunitinib可以有效抑制K562、K562G和K562A细胞增殖，参与的机制可能有诱导细胞周期的改变，包括S期比例下调和G2/M期阻滞，以及通过上调Caspase3基因并下调Mcl-1基因mRNA水平的表达诱导细胞凋亡。本研究为Sunitinib在治疗Imatinib耐药的慢性粒细胞性白血病病人中进行临床试验提供可靠的实验依据。