人源20S蛋白酶体激活因子REGγ结构与功能研究

摘要

蛋白酶体是普遍存在于古菌，真核生物以及一些细菌中的一种降解蛋白质的复合物，在细胞的生命活动中起着重要的作用。目前关于蛋白酶体激活机制的研究主要包括两个方面:泛素化及ATP依赖的蛋白酶体激活途径;非泛素化及ATP依赖的蛋白酶体激活途径。
　　Smurf1与Smurf2是泛素-蛋白酶体途径中的一种泛素连接酶E3，属于C2-WW-HECT家族的泛素连接酶，在蛋白质泛素化中起着重要的作用，同时在骨的分化以及RhoA信号转导中也起着关键的作用。Smurf2中的C2结构域与HECT结构域通过分子内的相互作用而抑制其自身的连接酶活性，但是关于Smurf1-C2结构域的功能还不是很清楚。因此本论文通过结构生物学对Smurf1-C2结构域进行研究，为以后更深入了解其重要功能奠定了基础。
　　REG家族是一种不依赖于泛素化及ATP激活蛋白酶体酶活性的蛋白酶体激活因子，通过结合到桶状蛋白酶体的末端来激活其特异的蛋白酶活性。其中REGγ只能特异性的激活蛋白酶体降解碱性氨基酸形成的肽键，而且是目前发现的唯一一种能激活蛋白酶体降解完整蛋白（如p21，SRC-3）的激活因子。所研究的Smurf1蛋白是最近被报道通过REGγ-蛋白酶体途径进行降解的。同时REGγ在细胞周期，细胞凋亡，病毒感染，癌症的发生及其他人类疾病中都起着重要的作用。因此通过结构生物学的手段对REGγ进行研究，进而揭示出REGγ激活蛋白酶体的重要机制。
　　本论文的第一部分的研究内容是对Smurf1-C2结构域进行了晶体学及细胞功能学的研究，通过X射线衍射获得并解析了分辨率为2(A)的Smurf1-C2三维结构。其空间结构由典型的反平行β片层组成，并结合有两个硫酸根离子以及一个氯离子，通过对顶端硫酸根结合位点的分析，发现两个重要的氨基酸残基:K28与K85。继而通过定点突变及细胞定位实验证明:Smurf1-C2结构域对于Smurf1在细胞中的定位起着非常重要的作用，并非像Smurf2-C2对Smurf2-HECT的分子内自抑制作用;同时证明Smurf1-C2与细胞膜的结合方式是非钙离子依赖型的。
　　本论文的第二部分的研究内容为解析了分辨率为3(A)的REGγ七聚体的结构，同时解析了突变体REGγ-linker的结构，即用人工六肽(GAVSAG)来取代REGγ蛋白序列中60位到107位的氨基酸残基。通过对REGγ-linker结构分析，蛋白酶体的激活实验以及细胞定位实验表明:60位到107位柔性区不影响REGγ的空间结构及对蛋白酶体酶活性的激活，但使RE研的定位从细胞核中转移到了细胞质中，揭示出该区域含有核定位信号。
　　本论文的第三部分的研究内容是对突变体REGγ-linker(K188E)结构进行了解析，通过对其结构分析以及与REGγ结构的比对发现蛋白酶体激活区域(143位到152位氨基酸残基)和结合蛋白酶体的C末端均发生了重要的构象变化:E链和D链中150位的甘氨酸构象都发生了改变。通过定点突变及蛋白酶体激活实验证明，150位的甘氨酸以及148位的谷氨酸在REGγ激活蛋白酶体酶活性中起着非常关键的作用，同时研究还进一步揭示出REGγ具有不同于低等生物中蛋白酶体激活因子PA26激活蛋白酶体的机制。
　　本论文的研究结果为以后关于Smurf1在细胞生命活动中的功能研究提供了理论基础，同时为研究REGγ激活蛋白酶体酶活性的详细机制以及REGγ在细胞中重要的生物学功能提供了结构上重要的依据。