酶法拆分制备D-丝氨酸以及近红外在线监控酶法转化制备γ-氨基丁酸

摘要

20世纪初期人类发现了味精，并开始使用发酵法大规模地生产各种常见氨基酸，到了21世纪氨基酸产业经历了100年的发展，由于高能耗以及行业间的价格打压，氨基酸产业慢慢地被少数几家大公司所垄断。然而小品种氨基酸包括各类D型氨基酸由于其独特的生理生化功能，已经被制成多种类型的保健品，开始被人们慢慢地接受，逐渐受到重视。小品种氨基酸刚刚起步，由于无法使用传统发酵大规模生产，因此生产工艺尚待开发。
　　论文采用最新的基因工程技术，制得高丝氨酸羟甲基转移酶活力的菌体细胞，为L-丝氨酸的合成提供上游技术支持。使用实验室之前克隆表达的色氨酸酶，为下游同时生产D-丝氨酸及L-色氨酸提供了绿色的合成思路。沿用实验室之前克隆表达的高活力谷氨酸脱羧酶，为γ-氨基丁酸的中试生产提供了指导性的建议。同时使用近红外光谱分析技术对γ-氨基丁酸的酶促转化制备过程进行了实时监控，为小品种氨基酸的酶法转化清洁生产以及在线监控奠定了基础。
　　本论文首先以E.coli BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增丝氨酸羟甲基转移酶基因。构建重组载体pET-21 a(+)-SHMT，在基因水平、蛋白水平和酶活力测试中，同时证明了该酶的成功表达，克隆表达出来的丝氨酸羟甲基转移酶活力是正常E.coli BL21(DE3)菌株活力的10倍。
　　在使用色氨酸酶催化D，L-丝氨酸和吲哚制备L-色氨酸和D-丝氨酸时，应用响应面分析法对合成条件进行了优化，得到了酶法合成的最优条件:色氨酸酶质量浓度为6g/L，D，L-丝氨酸质量浓度30 g/L，吲哚60 g/L，反应温度45℃，反应pH8.0，反应时间18 h，经过两次转化，产物L-色氨酸的总转化率可达95.4％。D-丝氨酸的，比旋光度-15.3°(C=10，2N HCl)同标准品D-丝氨酸一致，化学纯度为99.4％，提取分离的总回收率为66.6％。
　　对以L-谷氨酸为底物利用谷氨酸脱羧酶酶法制备γ-氨基丁酸的合成条件进行优化，得到了酶法合成的最优条件:高产谷氨酸脱羧酶细胞液以2.48 g/(L·h)的速度流加4.33h，终酶量达到10.7 g/L，反应在5h即可完成。同时使用近红外光谱分析技术实时监控反应过程，为了克服不溶性底物以及混悬菌体细胞液的干扰，设计了19μm和0.2μm的串联过滤膜系统，得到了澄清液体的近红外模型，L-谷氨酸浓度范围在3.54 g/L-41.91g/L波动条件下的预测精度（RMSEP）为1.58 g/L，γ-氨基丁酸在7.05 g/L-125.52 g/L的波动条件下预测精度(RMSEP)为3.07 g/L。最后对10L反应体系下的转化液进行分离提取，产品总收率70％，而且产品质量符合日本味之素企业标准AJI92。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 氨基酸研发近况

1．1．1 氨基酸的定义

1．1．2 氨基酸的功能

1．1．3 氨基酸的生产方法

1．1．4 氨基酸的检测方法

1．1．5 我国氨基酸生产的趋势

第二节 近红外光谱分析技术

1．2．1 近红外光谱分析技术的特点

1．2．2 近红外光谱技术的应用范围

1．2．3 近红外光谱技术的操作流程

第三节 D-丝氨酸／γ氨基丁酸产品介绍

1．3．1 D-丝氨酸的生理功能及生产方法

1．3．2 γ-氨基丁酸的生理功能及生产方法

第四节 本课题的研究内容与意义

第二章 大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶的克隆表达

第一节 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

第二节 实验方法

2．2．1 丝氨酸羟甲基转移酶的克隆与表达

2．2．2 丝氨酸羟甲基转移酶的活力测定

2．2．3 丝氨酸羟甲基转移酶转化制备L-丝氨酸

第三节 实验结果

2．3．1 丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆与鉴定

2．3．2 丝氨酸羟甲基转移酶蛋白活力测定结果分析

2．3．3 丝氨酸羟甲基转移酶转化制备L-丝氨酸结果分析

第四节 讨论与小结

第三章 色氨酸酶酶法转化制备D-丝氨酸与L-色氨酸

第一节 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

第二节 实验方法

3．2．1 DL-丝氨酸与L-色氨酸含量测定方法

3．2．2 色氨酸酶酶促反应响应面设计及酶促反应方法

3．2．3 D-丝氨酸与L-色氨酸分离方法及产品检验

第三节 实验结果

3．3．1 色氨酸酶酶促反应响应面结果

3．3．3 DL-丝氨酸与L-色氨酸含量测定结果分析

3．3．4 D-丝氨酸质量检测

第四节 讨论与小结

第四章 近红外在线监控谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸

第一节 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

第二节 实验方法

4．2．1 谷氨酸脱羧酶酶活测定方法

4．2．2 谷氨酸脱羧酶酶法转化制备γ-氨基丁酸过程监测体系

4．2．3 在线膜过滤装置设计

4．2．4 L-谷氨酸与γ-氨基丁酸定量测定方法

4．2．5 近红外光谱采集

4．2．6 校正集与检测集

4．2．7 光谱数据预处理

4．2．8 波段选择方法

4．2．9 谷氨酸脱羧酶酶促反应响应面设计

4．2．10 γ-氨基丁酸分离方法及质量检测

第三节 实验结果

4．3．1 L-谷氨酸与γ-氨基丁酸含量测定结果分析

4．3．2 近红外模型的建立与选择结果分析

4．3．3 谷氨酸脱羧酶促反应响应面结果及模型验证

4．3．4 γ-氨基丁酸产品质量检测

第四节 讨论与小结

展望

创新点

参考文献

致谢

个人简历及学术论文情况