慢性抑制代谢性谷氨酸受体5对小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠孤独症样行为的影响

摘要

目的：孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders, ASD）是一种广泛性神经系统发育性疾病，人群发病率约为1％，给社会和家庭都造成了很大负担。ASD以持续性的社会交往障碍和重复刻板动作为特征。虽然近些年对孤独症的研究呈指数上升，然而对于孤独症的发病机制至今仍未阐明。近年来发现小脑可能在孤独症发病中起重要作用。在ASD患者标本中可以看到小脑浦肯野细胞减少，围产期小脑损伤也和 ASD发病有关。结节性硬化（ Tuberous sclerosis complex，TSC）是一类可以合并有ASD的遗传性疾病，由Tsc1或Tsc2基因突变，过度激活mTOR（mammalian target of rapamycin）通路引起。在TSC患者中也发现有小脑的病变，并且小脑病变和ASD症状有关。前期研究发现小脑浦肯野细胞（Purkinje cell，PC）Tsc1基因纯合突变的小鼠可以出现孤独症样的表现，包括社会行为异常，重复刻板动作等。代谢性谷氨酸受体5（metabotropic glutamate receptor5, mGluR5）是调节兴奋性神经递质传递的重要受体，目前在许多症状性孤独症和非症状性孤独症中均发现 mGluR5抑制剂可以改善孤独症相关的行为学表型，提示 mGluR5可能为孤独症的潜在治疗靶点。本研究旨在使用已经证实的孤独症模型 PC Tsc1突变小鼠来测试是否负性调节 mGluR5受体可以改善其孤独症样表现。
　　方法：我们使用Tsc1 flox/flox（野生型，WT）和Tsc1flox/flox, L7Cre（PC Tsc1突变型，MUT）小鼠，从生后21天给予 mGluR5抑制剂 CTEP2mg/kg或给予同等剂量的Vehicle治疗。实验分组如下：WT+VEH， MUT+VEH，WT+CTEP， MUT+CTEP组。每48小时给药一次。治疗两周后开始进行行为学观察。我们对小鼠进行转棒试验、旷场试验、刻板行为观察、三厢试验、社会嗅觉试验、T型水迷宫试验等行为学测试。于10-12周灌注取脑，冰冻切片进行小脑免疫荧光染色，calbindin抗体染色检测浦肯野细胞数量，磷酸化 S6，磷酸化 Erk抗体染色检测表达水平。振动切片进行高尔基染色比较各组浦肯野细胞的树突棘密度。
　　结果：与 WT+VEH组相比，MUT+VEH组小鼠运动协调性明显差，转棒实验中在棒上停留时间明显缩短，重复清洁动作时间明显增加，社会交往以及社会新奇能力变差，社会嗅觉变差，逆转记忆力明显下降。而 CTEP慢性治疗可以缓解 PC Tsc1突变小鼠的运动症状，恢复 PC Tsc1突变小鼠的社会交往和社会新奇能力，以及社会嗅觉表现。但逆转记忆能力未得到明显改善。从组织学层面，我们发现 CTEP慢性治疗可以减轻突变小鼠小脑浦肯野细胞丢失，抑制突变小鼠中升高的pS6和pErk水平。
　　结论：我们发现应用mGluR5的负性变构调节物CTEP慢性治疗可以纠正小脑浦肯野细胞 Tsc1基因敲除小鼠的孤独症样行为，改善突变小鼠的运动协调性。这个作用机制可能与 mGluR5对 mTOR通路，Erk信号通路的调节有关。我们的结果说明了小脑浦肯野细胞 Tsc1基因敲除小鼠的发病可能与突触的异常信号调节有关，通过靶点药物治疗可以改善。也进一步提示症状性或非症状性 ASD可能都有共同的病理生理过程，与突触调节的蛋白合成有关。

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第一章 引言

第一节 孤独症概述

第二节 结节性硬化，小脑和孤独症

第三节 代谢性谷氨酸受体5相关研究进展

第四节 目前存在的争议

第五节 本研究的意义和目的

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料、主要试剂与实验仪器

第二节实验方法

第三章 结果

第一节 小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠的鉴定

第二节 小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠基本形态分析

第三节 小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠小脑组织学改变

第四节 小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠孤独症样行为分析

第五节 CTEP对小脑浦肯野细胞Tsc1基因敲除小鼠的影响

第四章讨论

第一节 可能的机制

第二节 I组代谢型谷氨酸受体和孤独症

第三节 小脑和孤独症

第四节 本研究的不足之处

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历