固氮施氏假单胞菌RNA分子伴侣蛋白Hfq与碳代谢抑制蛋白Crc在碳代谢途径中的协同作用

摘要

微生物在多种碳源存在的情况下，优先选择优势碳源而抑制非优势碳源的利用，这种现象称为碳代谢物抑制。在假单胞菌中，全局调控因子Crc被认为是参与碳代谢抑制调控的核心蛋白，可通过与靶标基因的mRNA互作进而发挥调控作用。近年来，有研究认为RNA分子伴侣Hfq参与了Crc与靶标mRNA的分子互作，Hfq可通过与mRNA分子的互作进而调节其稳定性目前关于两种不同的学术观点仍存在争议，而Hfq和Crc在固氮菌中的研究尚未见报道。固氮施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际，如何高效利用根际环境中复杂的碳源对该菌的根际定殖及环境适应至关重要，但是该菌中Crc与Hfq蛋白在碳源利用调控过程中的功能及其协同作用缺乏分子证据。本研究在实验室已有hfq突变株和crc突变株基础上，通过hfq和crc双突变株的构建，重点分析了Hfq和Crc在混合碳源利用中的生理生化表型，初步研究了Hfq及Crc在碳代谢调控中的作用机制，取得了以下结果：
　　1、研究了Hfq和Crc蛋白在碳代谢途径中的生物学功能。分别测定了hfq和crc单突变株和双突变株在单一碳源及混合碳源（优势碳源与非优势碳源混合）条件下的生长能力，结果发现，在优势碳源（乳酸钠和琥珀酸）为单一碳源条件下，突变株与野生型的生长能力均无显著差异，而在两种非优势碳源（苯甲酸和葡萄糖）为唯一碳源条件下，crc和hfq单突变株生长能力显著下降，而双突变株基本不能生长。在优势碳源乳酸钠与非优势碳源苯甲酸混合培养条件下，crc和hfq单突变株生长能力增强，而双突变株生长能力较弱。以上结果表明，在非优势碳源存在的情况下（无论单一碳源或混合碳源），crc和hfq双突变株产生的表型变化水平都显著强于单突变株，暗示两者可能存在功能上的叠加。以苯甲酸代谢为研究对象，通过实时定量RT-PCR分析了苯甲酸存在条件下（单一、混合碳源）苯甲酸降解关键基因的表达变化，结果表明，与野生型和单突变株相比，crc和hfq双突变株中苯甲酸代谢基因benA、benR、benK表达量显著下调。根据以上结果，推测在A1501菌中，Hfq和Crc在碳源代谢途径中发挥着协同作用。
　　2、采用原核表达体系表达纯化了Crc和Hfq蛋白，并通过微量热涌动实验（MST）检测了Crc和Hfq蛋白与靶标分子BenR（苯甲酸降解调控基因）的mRNA的体外互作。结果显示，Hfq可与苯甲酸降解调控基因benR特异性结合。说明Hfq参与了以Crc为主要调控蛋白的碳代谢抑制途径。
　　3、施氏假单胞菌A1501中hfq和crc基因的同时突变并不影响菌株在LB培养基中的生长。在低氨、微好氧条件下的固氮酶活测定显示hfq和crc基因突变后施氏假单胞菌A1501的固氮酶活明显下降。并且氮代谢调控基因（nifA、nifK、glnA、glnK）表达量都发生下调。与此同时hfq和crc基因突变后使A1501丧失趋化能力，说明Hfq和Crc在A1501的固氮过程中同时发挥重要的功能，从而影响其它代谢途径。
　　综上所述，施氏假单胞菌A1501调控蛋白Crc与Hfq在碳代谢抑制调控中存在协同作用，同时Crc与Hfq蛋白可能以某种未知的调控方式协同参与了该菌固氮、逆境胁迫及运动等生理过程。本研究为施氏假单胞菌A1501的碳氮代谢调控网络研究奠定了重要的理论基础。

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1 绪论

1.1 前言

1.2 Crc在碳代谢途径中的作用方式及其研究现状

1.2.1 Crc在假单胞菌碳代谢途径中的作用方式

1.2.2 Crc在醋酸钙不动杆菌碳代谢途径中的作用方式

1.2.3 Crc在碳代谢途径中的研究现状

1.3 Hfq的发现，特征及研究现状

1.4 Crc与Hfq协同作用的研究现状

1.5 立题依据及主要研究内容

1.5.1 立题依据

1.5.2 研究内容

1.5.3 创新点

1.6 技术路线

2 施氏假单胞菌A1501中crc和hfq基因双突变株的构建及与野生型的生理生化表型对比鉴定

2.1 材料和方法

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 化学试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 三亲本结合试验

2.2.3 生长曲线的测定

2.2.4 固氮酶活的测定

2.2.5 ADP/ATP比值测定

2.2.6 过氧化氢冲击

2.2.7 趋化实验

2.2.8 Biolog分析野生型与突变株对碳源的利用情况

2.2.9 RNA的提取

2.2.10 cDNA链的合成

2.2.11 荧光实时定量PCR反应

2.3 结果分析

2.3.1 crc和hfq双突变株的构建

2.3.2 crc和hfq同时突变对菌株生长能力的影响

2.3.3 固氮酶活的测定

2.3.4 hfq和crc同时突变对固氮相关基因转录水平的影响

2.3.5 ADP/ATP比值测定

2.3.6 Biolog分析野生型以及突变株对不同碳源的利用情况

2.3.7 逆境胁迫试验

2.3.8 hfq和crc同时突变对氧化胁迫相关基因转录水平的影响

2.3.9 趋化实验

2.4 讨论

3 Crc与Hfq在碳代谢途径中的相互作用功能研究

3.1 材料

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 培养基

3.1.3 化学试剂

3.1.4 主要仪器

3.1.5 常用溶液

3.2 方法

3.2.1 生长曲线的测定

3.2.2 RNA的提取

3.2.3 cDNA链的合成

3.2.4 荧光实时定量PCR反应

3.2.5 Hfq蛋白的表达纯化

3.2.6 微量热泳动实验

3.3 结果与分析

3.3.1 crc和hfq双突变株在优势碳源条件下的生长曲线

3.3.2 crc和hfq双突变株与单突变株在非优势碳源及混合碳源条件下生长能力比较

3.3.3 hfq和crc同时突变对苯甲酸代谢相关基因转录水平的影响

3.3.4 Hfq蛋白纯化

3.3.5 微量热泳动实验（MST）检测Hfq蛋白与靶标分子互作

3.4 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果

附录