转2mG2-epsps基因抗草甘膦玉米品系分子特征及特异性检测

摘要

转基因玉米是最早获得商业化种植的转基因作物之一，也是世界上种植面积最大的转基因经济、粮食作物。我国至今尚无转基因玉米品系获批产业化生产，原因之一就是转基因玉米的分子特征信息不完善，阻碍了相应品系的安全评价工作。G2-epsps是本研究室自主克隆的抗草甘膦基因,根据植物密码子偏好性对G2-epsps进行优化，获得新型抗草甘膦基因2mG2-epsps。新型转2mG2-epsps基因玉米在田间试验中表现出良好的抗草甘膦特性。本研究以转2mG2-epsps基因玉米品系为研究对象，利用反转录（RT-PCR）和高效热不对称交互PCR（hiTAIL-PCR）技术及分子杂交技术，分析了插入外源 T-DNA的拷贝数及侧翼序列，建立了相应玉米新品系特异性检测方法。本研究获得了转基因玉米品系的分子特征信息、检测方法，为申请安全证书以及商业化后的检测、监管提供有力的保障。主要研究结果如下：
　　（1）利用反转录PCR和Western Bolt分析转基因玉米品系D、T255、T254、T257中外源基因2mG2-epsps的表达。结果表明，外源基因2mG2-epsps在转基因玉米品系D、T255、T254、T257中正常转录与表达，与本实验室自主研发的抗除草剂G2-EPSPS快速检测试纸条检测的结果一致。
　　（2）通过Southern Blot、微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR）测定转基因玉米品系D、T255、T254、T257插入外源基因T-DNA拷贝数。结果显示，转基因玉米品系D的外源基因拷贝数为2个，品系T254、T257外源基因拷贝数约为3，品系T255外源基因拷贝数约为4。因此将转基因玉米品系D作为下一步研究的材料。
　　（3）通过3'端1次hiTAIL-PCR和1次长链PCR扩增方法获得了转抗草甘膦基因2mG2-epsps玉米品系D的外源DNA插入片段的全DNA序列（T-DNA）及两端侧翼序列。发现外源插入序列共3827 bp，其中包括一个完整拷贝的2mG2-epsps基因序列，以及一个玉米泛素化启动子ubiquitin promoter、一个完整终止子 Nos-Ter，并且外源基因2mG2-epsps的5'端还带有叶绿体导肽CTP。外源T-DNA的第一个插入位点位于玉米基因组的Ⅰ号染色体上（227622408..227656679），第二个插入位点位于位于玉米基因组的Ⅱ号染色体上（113077961-113077617）。
　　（4）转基因玉米D品系特异性检测方法的建立。根据获得的外源T-DNA序列与玉米基因组的连接区即侧翼序列设计PCR检测方法的引物，建立了D品系特异性普通PCR检测方法，以非转基因玉米、油菜、水稻、大豆和转基因玉米、油菜、水稻、大豆为材料，验证该方法的特异性及灵敏度，最低检测限约为0.05％。

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1 绪论

1.1 转基因作物国内外发展状况

1.2 转基因玉米国内外发展状况

1.3 抗草甘膦EPSPS基因以及抗草甘膦玉米研究进展

1.4 国内外转基因作物的安全评价与管理

1.5 转基因植物中侧翼序列分析方法的研究

1.6 转基因作物检测技术及其发展

1.7 本研究的目的、意义、主要内容和技术路线

2 转2mG2-epsps基因玉米外源基因表达分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3 转2mG2-epsps基因玉米外源T-DNA插入拷贝数分析

3.1 材料和方法

3.2 结果分析

3.3 讨论

4 转2mG2-epsps基因玉米T-DNA侧翼序列分析与品系特异性检测方法建立

4.1 材料与方法

4.2 转基因玉米品系D特异性检测方法建立

4.3 结果与分析

4.5 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及专利

附录