传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达

摘要

传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科，主要引起猪的肠炎和严重的腹泻，新生仔猪的感染将导致严重的的死亡，给养猪业造成了巨大的危害和经济损失。TGEV基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28.5 kb，5’端20 kb序列编码病毒的复制酶多聚蛋白，3’端约8.3 kb编码4种结构蛋白(S、sM、M、N)和4种非结构蛋白，这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。其中S蛋白具有重要的生物学功能：携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点，决定其宿主组织细胞亲嗜性；是决定TGEV的毒力的基因之一；具有细胞膜融合作用，协助病毒从细胞核蛋白进入细胞浆；具有血凝活性区。目前，TGEV部分基因的功能还不完全清楚，因此本文拟通过RT.PCR的方法扩增获得TGEV的全长cDNA片段，并分段克隆大片段cDNA，为后期进行感染性克隆、基因功能研究、致病机制和疫苗的开发打下坚实的基础，也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考。 参考GenBank登陆的TGEV序列，设计了6对引物，以抽提的TGEV细胞毒总KNA为模板，分段扩增获得了TGEV.31、TGEV-32、TGEV一33、TGEV-34、TGEV-35、TGEV.36共6段PCR产物，其大小分别为1.5kb、2.0kb、1.1kb、1.4kb、1.4kb、1.3kb，扩增片段与pGM-T载体连接获得了pGMT-31、pGMT-32、pGMT-33、pGMT-34、pGMT-35、pGMT-36共6个克隆，分别克隆了1456bp、1957bp、1079bp、1362bp、1427bp、1327bp的TGEV cDNA片段，经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 3’8495bp的序列。基于TGEV S、M、sM、N、Nsp3a、Nsp3b、Nsp7的进化树分析表明，TGEV与TS、HN2002、T014、TS、PURDUE等毒株具有非常近的亲缘关系。 为了获得TGEV的全长cDNA，参考NCBI登陆的TGEV病毒的序列，设计了7对引物，以抽提的TGEV细胞毒的总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-A、TGEV.B、TGEV-CI(mu)、TGEV-C2(mu)、TGE~DE、TGEV-F 6片段PCR产物，其大小分别为6.2kb、5.3kb、2.3kb、3.0kb、6.9kb、5.1kb。通过点突变的方法运用，以TGEV-C1(mu)、TGEV-C2(mu)为模版，重叠PCR法扩增出了TGE~C片段，其大小为5.3kb。TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE、TGEV-F五个cDNA大片段，分别与pGM-T载体连接，结果仅成功克隆了其中的TGEV-A、TGEV-B、TGEV-F三个片段，分别命名为pTA-A、pTA-B、pGM-T。为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达，设计一对引物从TGEV细胞毒RNA中扩增出了包含S基因主要抗原的片段，分别连接pET32a(+)、pET28a(+)和pEGFP-C1表达载体，获得重组质粒pET32a-S、pET28a-S、pEGFPCI-S，并在大场杆菌和Vero细胞中分别进行了原核和真核的表达，结果pET32a-S、pET28a-S在Ecoli BL21细胞中未能获得良好表达，而pEGFPCI-S在Vero细胞中成功地获得了表达。 为了构建表达TGEV S基因主要抗原片段的PRV重组病毒，PCR扩增了S基因主要抗原片段，并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPl2．EGFP中，命名为pPPl2．EGFP．S，采用磷酸钙法将pPPl2．EGFP．S与SA215病毒基因组DNA共转染Vero细胞，结果在12小时以后可以观察到绿色荧光，24～48小时荧光到达最大量，48小时后荧光开始衰退，细胞在转染48小时后开始出现病变，96小时后细胞75％出现病变；在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞，挑取病灶反复纯化几次，获得了表达S基因主要抗原片断重组病毒PRV SA215-S，抽提病毒基因组DNA，PCR扩增能够从中扩增出大小为1.7kb的S基因主要抗原片段。 应用生物信息学软件分析了PRV和TGEV全基因序列的密码子偏爱性，分别计算了其RSCU、Nc、GC、GC<,3s>、双核苷酸组成，根据计算的结果运用GC<,3s>-+Nc分布图、GC<,12>-GC<,3s>散点图、对应分析解析了TGEV和PRV密码子用法发生偏爱的主要影响因素，结果表明，PRV主要偏爱于使用以G和C结尾的密码子，而TGEV则主要使用以A和U结尾的密码子，影响PRV密码子偏爱G、C的主要因素是碱基组成限制、碱基突变、翻译选择和基因功能，TGEV的影响因素则只有碱基组成限制、碱基突变，翻译选择对其密码子的用法无影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章文献综述

1.TGEV的分子生物学研究概况

1.1传染性胃肠炎病毒基因组学

1.2 TGEV蛋白结构和功能

1.3 TGEV变异性及致病性研究概况

1.4 TGEV反向遗传研究概况

1.5对传染性胃肠炎进一步研究的展望

2.伪狂犬病病毒基因缺失病毒及其表达载体研究进展

3.本研究的目的和意义

第二章传染性胃肠炎病毒3’端8.5kb片段的克隆及序列分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2仪器

1.3病毒RNA的提取

1.4 TGEV 3'端8.5kb片段分段扩增

1.5 TGEV 3'端8.5kb片段分段克隆

1.6 TGEV 3'端8.5kb片段序列特征分析

2.结果与分析

2.1 TGEV 3'端片段的分段RT-PCR扩增

2.2 TGEV 3'端片段的分段克隆

2.3 TGEV 3'端片段序列的生物信息学分析

3.讨论

4.结论

第三章传染性胃肠炎病毒大片段的扩增与克隆

1.材料与方法

1.1材料

1.2引物的设计与合成

1.3病毒RNA的提取

1.4 TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE和TGEV-F 5个片段RT-PCR扩增

1.5 TGEV-A、TGEV-B和TGEV-F 3个片段的克隆

2.结果与分析

2.1 TGEV-A片段的RT-PCR扩增

2.2 TGEV-B片段的RT-PCR扩增

2.3 TGEV-C片段的RT-PCR扩增

2.4 TGEV-DE片段的RT-PCR扩增

2.5 TGEV-F片段的RT-PCR扩增

2.6 TGEV-A片段的克隆

2.7 TGEV-B片段的克隆

2.8 TGEV-F片段的克隆

3讨论

4结论

第四章传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的原核表达和真核表达

1材料与方法

1.1实验材料

1.2 S基因主要抗原片段在原核表达载体pET32a(+)、pET28a(+)中的表达

1.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的表达

2.结果与分析

2.1 S基因主要抗原片段在pET32a(+)载体中的原核表达

2.2 S基因主要抗原片段在pET28a(+)载体中的原核表达

2.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的真核表达

3.讨论

4.结论

第五章传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达

1材料与方法

1.1实验材料

1.2含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建

1.3 TGEV S基因主要抗原片段与伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株SA215的同源重组及表达

2.结果与分析

2.1含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建

2.2 pPPI2.EGFP.S11#与SA215的同源重组

3.讨论

4.结论

第六章传染性胃肠炎病毒与伪狂犬病病毒全基因组密码子用法特点分析

1.材料与方法

1.1材料和软件

1.2实验方法步骤

2.结果与分析

2.1 TGEV和PRV分析的编码序列

2.2 PRV SA215株病毒gD基因序列的测定

2.3 PRV和TGEV RSCU值、Nc值、GC、GC3s等各项参数的计算

2.4影响PRV和TGEV密码子偏向性因素初步分析

3.讨论

4.结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文