不同菌剂处理对猪粪堆肥效果的影响及PCR-DGGE研究堆肥微生物群落变化

摘要

为研究接种菌剂对堆肥效果的影响及其在堆肥中的变化规律，以及对堆肥微生物群落变化的影响，并探讨动物微生态制剂用于堆肥的可行性，本研究从猪粪腐熟堆肥中筛选优势微生物并制作成复合菌剂，研究复合菌剂和微生态制剂对堆肥效果的影响，并采用PCR-DGGE技术研究堆肥微生物的群落变化，结果如下： 1.复合菌剂和微生态制剂对堆肥效果的影响 利用选择性平板培养和高温筛选从猪粪腐熟堆肥中分离微生物，从中筛选10株堆肥微生物，3株能够耐受80℃高温的芽孢杆菌，3株中温放线菌，3株霉菌和1株酵母菌，用以上菌株制备复合菌剂。将复合菌剂和微生态制剂分别按0.1％比例接种猪粪堆肥，共分成4组：T1是接种堆肥分离的复合菌剂组，T2是微生态菌剂组，T3是微生态菌剂组(接种菌剂浓度是T2的1倍)，设不接种菌剂组为对照组。通过测定堆肥30d内温度、pH、水分、全碳、全氮和C/N，评价接种菌剂对堆肥效果的影响。结果表明：整个堆肥过程中，接种堆肥分离微生物和微生态菌剂组的温度显著高于对照组，最高温度也显著高于对照组，T1组最高温度达到73℃，T2为74℃，T3为72℃，对照组为71.5℃。接种菌剂组堆肥高温期持续时间显著比对照组长，堆肥温度在50℃以上维持的时间T2、T3最长，都是23天，T1为21天，而对照组C只有10天。各组水分变化趋势相似，随着堆肥的进行，堆肥水分逐渐下降。各组pH值变化趋势基本一致，堆肥初期呈逐渐上升趋势，堆肥后期则逐渐下降。堆肥结束时，接种菌剂组对碳素的利用率显著高于对照组，T1的全碳含量下降了11.88％，T2下降了5.75％，T3下降了12.96％，而对照组只下降了4.73％。堆肥结束时，T1组和T3组C/N下降最多。综合各项物理化学指标来看，接种堆肥分离微生物的处理组T1效果最好，接种动物微生态制剂的处理组T2和T3的效果也较好，表明动物微生态制剂用于堆肥是可行的。 2.PCR-DGGE技术研究接种菌剂对堆肥微生物的群落变化的影响 通过抽提不同时期堆肥细菌总DNA，PCR扩增细菌16SrDNAV3区和DGGE电泳，进行DGGE图谱聚类分析和条带多样性的分析，结果表明：堆肥过程中细菌种类数量随着堆肥的升温期、高温维持期和降温期的变化呈现出“升高-降低-升高”的变化趋势。各阶段出现不同的菌群组成，接种菌剂堆肥细菌群落变化较对照组慢。堆肥初始，菌群组成主要是土著微生物，各组相似性为93％-100％；与其他时期的堆肥DGGE条带组成相似度仅为50％。第0-3天，此阶段温度上升较快，细菌群落多样性开始下降，不耐受高温的菌群逐渐消失并伴随着优势菌群的出现。接种的堆肥分离微生物和动物微生态制剂在DGGE图谱中检测出来，其中芽孢杆菌与高温期的优势条带相对应。第9-21天，各组DGGE图谱的相似性为68％，对照组菌群多样性较接种菌剂组高，但接种菌剂组优势菌群明显，且维持时间较长，表明堆肥高温阶段菌群的变化与堆肥温度的变化有关，对照组温度低，更利于不耐受高温菌群的生长；接种菌剂增加了高温期优势菌群的数量。第21-30天为堆肥降温腐熟期，堆肥细菌组成逐渐趋于稳定，各组DGGE图谱相似性为93％-100％，细菌菌落多样性高于堆肥高温期。此阶段接种菌剂组菌群多样性高于对照组，表明在堆肥后期，接种菌剂对堆肥菌群变化有影响，主要是增加了菌群多样性，并且通过前期对堆肥基质的分解，有利于后期的菌群生长。 本研究结果表明，接种菌剂能显著提高堆肥温度，延长高温持续期，加速堆肥基质的分解。通过接种菌剂改变了堆肥微生物的菌落变化，增加了优势菌群的数量和堆肥腐熟期微生物群落的多样性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1堆肥微生物的种类

1.2优势菌剂筛选和接种的研究进展及应用

1.2.1堆肥过程中微生物种群的变化

1.2.2复合微生物的筛选与接种

1.2.3高效复合微生物菌群的筛选接种应用

1.2.4堆肥微生物技术现存在的问题以及展望

1.3 DGGE技术在堆肥微生物群落研究中的应用

1.3.1 DGGE技术的原理

1.3.2 DGGE在堆肥微生物群落研究中的应用

1.4目的意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1培养基

2.1.2菌剂

2.1.3堆肥材料

2.1.4试剂

2.1.5主要仪器

2.2方法

2.2.1堆肥微生物的分离筛选

2.2.2堆肥菌剂的制作

2.2.3堆肥试验

2.2.3 PCR-DGGE技术分析堆肥细菌群落的变化

3结果

3.1堆肥微生物的分离筛选

3.2堆肥试验

3.2.1堆肥物理性状的变化

3.2.2堆肥温度的变化

3.2.3水分的变化

3.2.4 pH的变化

3.2.5全碳的变化

3.2.6全氮的变化

3.2.7 C/N的变化

3.3 PCR-DGGE技术分析堆肥细菌群落的变化

3.3.1堆肥样品微生物总DNA的提取

3.3.2堆肥细菌基因组总DNA 16S rDNA V3区扩增

3.3.3堆肥细菌基因组16S rDNA V3区扩增DNA片段DGGE分析

4讨论

4.1堆肥微生物的分离

4.2接种菌剂对堆肥物化性质的影响

4.2.1接种菌剂对堆肥温度的影响

4.2.2接种菌剂对堆肥水分的影响

4.2.3接种菌剂对堆肥pH的影响

4.2.4接种菌剂对堆肥C、N的影响

4.3接种菌剂对堆肥微生物群落变化的影响

4.4展望

5结论

参考文献

附录 试剂配制

致谢