鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究

摘要

本研究从鲤（Cyprjnus carpio）肠道及养殖水体分离筛选具有耐热和抑制病原菌功能的益生菌，并对其进行鉴定，在体外研究了部分益生菌对鲤前肠粘液的粘附特性及对病原菌粘附的抑制作用等生物学特性，并探讨了所筛选的枯草芽孢杆菌、肠球菌及光合细菌等3株益生菌对鲤肠道免疫机能、消化酶、肠道菌群结构与多样性及鲤肌肉品质、生长性能等的影响。各试验的研究结果如下： 试验一、试验二中，从养殖池、水族箱和健康鲤肠道等分离20株细菌，以及四川农业大学动物微生态研究中心提供的8株供试细菌共28株，通过耐热和体外拮抗试验筛选出5株细菌，经生化试验和细菌16S rDNA测序鉴定为2株芽孢杆菌（Bacillus）、2株肠球菌（Enterococci）和1株柠檬酸杆菌（Citrobacter）。进一步采用体外固定鲤前肠黏液蛋白，结合同位素32P标记细菌并示踪的方法，研究来源于鲤肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及鲤养殖水体中的芽孢杆菌对鲤前肠黏液的体外黏附活性，建立筛选鲤益生菌的方法。结果表明，5株细菌均能黏附到黏液体外模型，肠球菌的相对黏附率极显著高于芽孢杆菌与柠檬酸杆菌（P<0．01），柠檬酸杆菌与芽孢杆菌的相对黏附率差异不显著（P>0．05），而肠球菌L2的相对黏附率极显著高于肠球菌E2（P<0．01）。结果证明，鱼源的肠球菌对鲤前肠黏液的黏附率高于异源的芽孢杆菌，而且不同种属的肠球菌在黏附能力上也存在差异。 试验三、试验四中，选择枯草芽孢杆菌制剂（B组，由Z2菌株制成），枯草芽孢杆菌和光合细菌（四川农业大学动物微生态研究中心提供）混合制剂（C组），枯草芽孢杆菌和肠球菌（由L2菌株制成）混合制剂（D组）3种益生菌组合，并将每一种制剂在同一浓度水平与对照组（A组）进行比较，分析试验组对鲤鱼免疫功能及鲤肠道消化酶的影响。结果表明：试验B组、C组中鲤的白细胞吞噬、杀菌活性、血清溶菌酶活性与对照组A差异显著（P<0．05），而试验D组上述3项指标都高于对照组A，但效果没有试验B、C组好，而3个试验组与对照组中淋巴细胞数差异不显著（P>0．05）。证明：单独使用枯草芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌和光合细菌复合制剂，以及枯草芽孢杆菌和肠球菌复合制剂更能有效地提高鲤鱼的白细胞的吞噬活性、杀菌活性和血清溶菌酶活性。同时，结果还表明：试验后期B组淀粉酶比活显著提高（P<0．05），脂肪酶、胰蛋白酶比活力极显著提高（P<0．01）。C组、D组胰蛋白酶比活力极显著提高（P<0．01），但对淀粉酶和脂肪酶比活力的影响差异不显著（P>0．05），特别是D组与A组的淀粉酶比活力在各阶段差异均不显著（P>0．05）。在整个试验中，B组对鲤肠道消化酶比活的提高效果最好。 试验五中，采用PCR-DGGE技术研究了不同组合的益生菌制剂对鲤肠道菌群结构与多样性的影响。结果表明：B组、C组和D组均能提高鲤肠道菌群的多样性。其中，试验B组鲤肠道菌群的多样性、优势菌群条带较对照组A明显提高，到42 d时条带增加量为9条；而试验C组鲤肠道菌群的多样性、优势菌群高于对照组A，到42 d时条带增加量为4条，但效果没有试验B组好，而D组的效果不明显。 试验六中，研究了不同益生菌组合对鲤肌肉氨基酸含量、肉质及生长性能的影响。结果表明，在生长方面，与对照组相比，试验B、C、D组试验组鲤的生长性能指标均高于对照组。其中B组的丰满度、绝对生长率、相对生长率、瞬时生长率、生长比速等均达到同阶段的峰值，与对照组相比，试验B、C组绝对生长率与瞬时生长率显著提高（P<0．05）；在肌肉品质方面，与对照组相比，添加益生菌的3组试验组（B、C、D组），鲤肌肉粗脂肪含量、失水率极显著降低（P<0．01）；肌肉粗蛋白含量显著增加（P<0．05）；其中，试验B组显著程度最高。上述结果表明，3种益生菌组合对鲤均有一定的促生长作用，并对肌肉品质有明显的改善作用，其中，又以枯草芽孢杆菌菌剂单独使用效果最明显。 综上所述，在鲤肠道、养殖水体广泛分布着益生菌。本研究通过普通培养和选择培养的方法，并通过耐热及体外抑制试验，筛选出枯草芽孢杆菌Z2、肠球菌L2等2株益生菌对致病性大肠杆菌、气单胞杆菌等有害菌有较强的抑制活性，并首次采用体外固定鲤前肠黏液，结合同位素32P示踪的方法，对来源于鲤肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及养殖水体的芽孢杆菌的细菌表面凝集素黏液蛋白受体的化学组成、其对病源菌附着鲤前肠黏液的影响等进行了研究，进一步探讨了益生菌的抑菌机理。同时本研究还首次探讨了不同益生菌组合对鲤免疫机理、肠道消化道酶活、肠道菌群结构与多样性、鲤肌肉品质及生产性能等的影响，结果表明，3种益生菌组合均可提高鲤免疫机能、消化道酶活性；增加鲤肠道菌群微生物多样性；改善鲤肌肉品质；提高生长性能。其中又以单株枯草芽孢杆菌制剂对以上指标的影响最大，作用效果最明显。该研究项目筛选的枯草芽孢杆（Z2）有望开发成鲤和其它鱼类养殖应用的益生菌。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分 水产动物益生菌研究进展

1 鱼类肠道微生物区系及其调控的研究进展

1.1 鱼类肠道微生物的建立

1.2 鱼消化道微生物区系

1.3 鱼类消化道菌群的作用

1.4 研究肠道菌群的新方法

1.5 影响鱼类肠道微生物区系的因素

1.6 鱼类肠道微生态调控的途径

2.水产动物益生菌的研究进展

2.1 益生菌的菌株特点

2.2 益生菌的作用机理

2.3 益生菌调控水产动物肠道微生态的可行性

2.4 益生菌在水产养殖业的应用

3.水产养殖中益生菌的常用菌株及筛选

3.1 常用菌株

3.2 益生菌的筛选

第二部分 本论文问题的提出及拟探讨的问题

1 研究主题的提出

2 本研究拟探讨的问题

2.1 鲤益生菌的筛选和鉴定

2.2 分离的5 株益生菌与鲤肠黏膜的体外黏附试验

2.3 不同益生菌对鲤消化道酶活性的影响

2.4 不同益生菌对鲤免疫机能的影响

2.5 以PCR—DGGE技术研究不同益生菌对鲤肠道菌群结构与多样性的影响

2.6 不同益生菌对鲤肌肉成份、肉质及生长性能的影响

第三部分 试验研究 试验一 鲤益生菌的筛选与鉴定

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 菌株的分离、纯化

1.3 拮抗实验

1.4 耐热实验

1.5 菌株的鉴定

1.6 菌株的安全性试验

1.7 活菌数检测

1.8 数据分析

2 结果与分析

2.1 菌株的分离结果

2.2 体外拮抗结果

2.3 耐热试验结果

2.4 种属鉴定结果

2.5 安全试验

3 讨论

4 结论

第三部分 试验研究 试验二 5 株益生菌在体外对鲤前肠黏液的黏附特性研究

1 材料与方法

1.1 菌种以及培养条件

1.2主要仪器与试剂

1.3 同位素标记方法

1.4 鲤鱼前肠黏液蛋白的制备

1.5 黏液中蛋白含量的测定

1.6 细菌经修饰后黏附试验

1.7 黏液经修饰后黏附试验

1.8 细菌与病原菌相互作用黏附试验

1.9 数据分析

2 结果与分析

2.1 黏液中蛋白含量

2.2 修饰对益生菌黏附的影响

2.3 异源和同源菌与病原菌相互作用后的黏附

3 讨论

4 结论

第三部分 试验研究 试验三 不同益生菌对鲤免疫机能的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2试验鱼及饲养条件

1.3活菌数测定

1.4日粮配制

1.5试验设计及饲养管理

1.6血样采集

1.7白细胞悬液制备

1.8血清溶菌酶活性测定

1.9血液淋巴细胞性测定

1.10白细胞吞噬活性测定

1.11白细胞杀菌活性测定

1.12数据分析

2.结果

2.1饲料中活菌数量

2.2血清溶菌活性

2.3血液淋巴细胞数

2.4血液白细胞吞噬活性

2.5血液白细胞杀菌活性

3.讨论

3.1芽孢杆菌、光合细菌、肠球菌对水生动物免役功能的影响

3.2对鲤血清溶菌酶活性的影响

3.3对鲤血液淋巴细胞数

3.4对鲤血液白细胞吞噬和杀菌活性的影响

4.小结

第三部分 试验研究 试验四 不同益生菌对鲤肠道消化酶活力的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验鱼及饲养条件

1.3 日粮配制

1.4 试验设计及饲养管理

1.5 样品前处理

1.6 检测项目

1.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 淀粉酶比活

2.2 脂肪酶比活

2.3 胰蛋白酶比活

3 讨论

4 结论

第三部分 试验研究 试验五 采用PCR—DGGE技术研究不同益生菌对鲤肠道微生物群落结构和多样性的影响

1材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验鱼及饲养条件

1.3 日粮配制

1.4 试验设计及饲养管理

1.5 肠道内容物总DNA的提取

1.6 细菌16 S rDNA V3 区PCR扩增

1.7 细菌基因组总DNA 16 S rDNA V3 区扩增片段DGGE分析

2 结果分析

2.1 肠道细菌总DNA提取结果

2.2 各组样品PCR—DGGE图谱分析

2.3 试验14 d各组鲤肠道菌群结构多样性结果与分析

2.4 试验28 d各组鲤肠道菌群结构多样性结果与分析

2.5 试验42 d各组鲤肠道菌群结构多样性结果与分析

3 讨论

3.1 芽孢杆菌、光合细菌、肠球菌对动物肠道菌群的影响

3.2 枯草芽孢杆菌组对鲤肠道菌群的影响

3.3 枯草芽孢杆菌和光合细菌组对鲤肠道菌群的影响

3.4 枯草芽孢杆菌、肠球菌组对鲤肠道菌群的影响

3.5 PCR—DGGE对肠道菌群研究的局限性

4 小结

第三部分 试验研究 试验六 不同益生菌对鲤鱼生长性能及肉质的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验鱼及饲养条件

1.3 日粮配制

1.4 试验设计及饲养管理

1.5 样品采集

1.6 测定指标与方法

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 生长性能

2.2 鲤肌肉基本成分指标

2.3 鲤肌肉失水率指标

2.4 鲤肌肉氨基酸组成的分析测定

3 讨论

3.1 益生菌对鲤鱼生长的促进作用

3.2 不同益生菌对鲤鱼肉质及营养成分的影响

4 结论

第四部分 本项研究创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文