吸附黄曲霉毒素B1乳杆菌的筛选、吸附特性及对攻毒小鼠的影响

摘要

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，具有很强的致癌、致突变和致畸性，可严重危害人和动物的健康。我国黄曲霉毒素的污染状况严重，而目前的常规脱毒方法存在着降低产品营养价值或去毒不彻底的缺陷，寻找一种安全有效的去毒剂是当前迫切需要解决的问题。近年来，乳酸菌吸附黄曲霉毒素的发现为生物脱毒提供了一条新的思路，因其温和的脱毒方式和潜在的益生作用，可认为是一种较理想的去毒方法。为了研究动物源乳杆菌吸附黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特性，及乳杆菌对AFB1中毒症的潜在疗效和作用机理，以期在该毒素的生物脱毒中得到应用，本文进行了以下研究： 1．吸附AFB1乳杆菌的筛选及其吸附特性研究。 从分离自动物肠道或粪便的14株乳杆菌中，结合高效液相色谱法（HPLC）筛选对AFB1具有最高吸附效率的乳杆菌。分别研究吸附时间（30 min和4 h）、热处理、人工胃肠液、冻干菌粉等因素对此菌株吸附AFB1效果的影响。 结果表明不同乳杆菌之间吸附效率差异明显，乳杆菌F22（L． plantarum F22）对AFB1具有最强吸附作用，吸附率可达到56．8％。大肠杆菌O8（E．coli O8）和沙门氏菌339（Salmonella339）对AFB1也有一定吸附效果。乳杆菌F22与AFB1共同培养30 min的吸附率极显著高于240 min时的吸附率（P<0．01）。热处理乳杆菌F22使其对AFB1的吸附率极显著增加（P<0．01）。在人工胃液和肠液环境中，乳杆菌F22吸附AFB1能力表现为极显著（P<0．01）和显著（P<0．05）下降。而F22冻干菌粉与活菌对AFB1的吸附能力相比较稍有下降，但影响不显著（P>0．05）。结果提示，乳杆菌对AFB1的吸附具有种间差异，吸附效果与细菌细胞壁的组成和结构相关；吸附作用是一个快速的过程，并随时间的增加有少量结合不紧密的AFB1脱离出来；热处理和胃肠液处理通过改变细菌胞壁的结构，影响吸附位点的暴露数量，从而导致不同的吸附效果；热处理结果还排除了F22通过生物代谢清除AFB1的假设。 2．乳杆菌F22对AFB1攻毒小鼠的影响研究。 选用5周龄的健康雄性昆明小鼠70只，随机分为4个组：（Ⅰ）乳杆菌低剂量组（1×109CFU/0．5mLPBS）；（Ⅱ）乳杆菌高剂量组（1×1010CFU/0．5 mL PBS）；（Ⅲ）阳性攻毒组（250μg/kg体重，AFB1溶解在0．5 mL二甲基亚砜），（Ⅳ）阴性对照组（0．5 mL无菌PBS液）。每组设3个重复，每个重复5只小鼠。预饲期3d，正式试验共10 d。饲养试验结束后，眼球采血，取相关组织样品进行血清生化指标及酶活性指标、组织病理变化、肠道菌群变化的测定，观察乳杆菌F22对AFB1感染模型的影响效果。 结果表明，攻毒AFB1使小鼠血清球蛋白（GLOB）、白蛋白（ALB）和总蛋白（TP）含量均降低（P>0．05）。血清酶活性指标中，AFB1攻毒使小鼠的谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和碱性磷酸酶（ALP）活性分别比阴性对照组升高了70．09％（P<0．01）、35．18％（0．010．05）。肝脏组织切片观察，AFB1攻毒组小鼠肝脏中央静脉充血，肝索紊乱，肝细胞颗粒变性和水泡变性。而在灌胃乳杆菌F22后，小鼠血清中各种蛋白的量增多，血清酶活性下降，肝细胞变性程度较攻毒组有明显缓解，肝组织部分区域再生现象明显，并随乳杆菌F22添加量的增多，恢复效果越佳。攻毒组小鼠盲肠菌群的变化为乳酸菌、双歧杆菌和总厌氧菌的数量下降，其中双歧杆菌和总厌氧菌数量下降显著（P<0．05）；肠道中的总需氧菌、肠杆菌和肠球菌都不同程度的升高，其中肠杆菌和总需氧菌数量升高显著（P<0．05）。说明AFB1中毒打破了小鼠肠道菌群的平衡。在灌胃了乳杆菌F22后，小鼠肠道菌群趋向正常范围恢复，并随乳杆菌F22添加量增加，恢复效果越好。结果提示，乳杆菌F22对AFB1中毒症有较好的缓解作用，能促进肝脏组织的修复，改善肠道微生态环境的平衡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

第一章 文献综述

1 黄曲毒素概述

1.1 黄曲霉的生长及产毒

1.2 黄曲霉污染概况与限量标准

1.3 黄曲霉毒素性质、毒性及代谢

1.4 黄曲霉毒素的危害

1.5 黄曲霉毒素的解毒措施

2 乳酸菌及其去毒概述

2.1 乳酸菌和乳杆菌的定义

2.2 乳杆菌的益生作用

2.3 乳酸菌对黄曲霉生长的抑制

2.4 乳酸菌对黄曲霉毒素的抑制或降解

2.5 乳酸菌对黄曲霉毒素的吸附作用

3 研究目的和意义

第二章 吸附 AFB1 乳杆菌的筛选及其吸附特性研究

1试验材料

1.1 试验菌株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 试验方法

2.1 吸附AFB1 乳杆菌的筛选

2.2 培养时间对吸附效果的影响

2.3 热处理对吸附效果的影响

2.4 人工胃肠液对吸附效果的影响

2.5 人工胃肠液中吸附稳定性研究

2.6 乳杆菌F22 冻干菌粉的制备和吸附效果

2.7 高效液相色谱条件

2.8 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 吸附AFB1 乳杆菌的筛选结果

3.2 乳杆菌F22 冻干菌粉的活性

3.3 乳杆菌F22 吸附AFB1 特性研究结果

4 讨论

4.1 吸附 AFB1 乳杆菌的筛选

4.2 乳杆菌F22 吸附AFB1 特性的研究

第三章 乳杆菌F22 对AFB1 攻毒小鼠的影响研究

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 主要试剂和培养基

2 试验方法

2.1 动物实验设计

2.2 检测样品的采集与保存

2.3 小鼠盲肠菌群检测

2.4 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 肝脏组织结构变化

3.2 血清生化指标的变化

3.3 活菌计数结果

4 讨论

4.1 乳杆菌F22 对AFB1 致肝组织损伤的影响

4.2 乳杆菌F22 对小鼠血清生化指标的影响

4.3 乳杆菌F22 对小鼠肠道菌群的影响

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文情况