添加苏氨酸和色氨酸对接种猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)弱毒苗生长猪免疫反应的影响

摘要

苏氨酸和色氨酸作为生长育肥猪的限制性氨基酸，分别通过提高机体的抗体、免疫球蛋白及急性期蛋白的合成和调节T细胞增殖来增强机体的免疫反应。在病毒感染或疫苗接种条件下，动物T细胞增殖的和免疫球蛋白的大量合成很容易引起日粮苏氨酸和色氨酸的缺乏和体蛋白的动员，进而降低机体的免疫反应。因此本试验以接种猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗的生长猪为对象，以体液免疫、细胞免疫、先天性免疫识别应答和组织病理学为评价指标，探讨在NRC（1998）推荐量的基础上提高苏、色氨酸水平对接种猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）弱毒苗生长猪的免疫保护效应及可能的机制。选取血缘相同，日龄体重相近的LY去势生长猪28头，正式试验时动物平均体重为29kg。利用常规（CON，Lys：thr：trp=100：64：18）和苏氨酸和色氨酸添加（TTR，Lys：thr：trp=100：80：26）饲粮处理，经ELISA检测，按照免疫接种和抗体水平分到6个处理组：本试验分为两个免疫处理组，分别为PBS处理组和PRRS疫苗处理组，其中PBS处理组选用PRRS阴性猪分别饲喂常规日粮（CON）和苏、色氨酸添加饲粮（TTR）作为阴性对照，同时PRRS疫苗处理组也分别饲喂常规日粮和苏、色氨酸添加饲粮，但在每个试验日粮处理下又分别选用PRRS阳性（PV+CON和PV+TTR）和阴性猪（V+CON和V+TTR）作为试验动物。正式试验分别饲喂CON（Lys：thr：trp=100：64：18）和TTR（Lys：thr：trp=100：80：26）日粮，饲喂试验饲粮21天后，进行第一次免疫接种，试验动物分别注射PRRSV弱毒苗（PRRSV MLV）和PBS溶液。第一次接种后35天进行第二次免疫接种。分别在试验开始当天，第一次免疫接种后0，7，14，21，28，35，49天采血收集血清。检测血清中PRRSV特异性抗体，中和抗体，免疫球蛋白，细胞因子（IFN-γ、IL-10、IL-1β）的浓度；在第一次免疫接种后第49天屠宰动物收集肺和淋巴结。利用普通PCR检测肺和淋巴结中PRRSV感染状况，利用RT-PCR方法检测目的基因Toll样受体3、7mRNA在肺和淋巴结中的表达量，并对肺和淋巴结进行组织病理学检测。结果表明： 1、第一次免疫接种后，PRRSV弱毒苗接种组与PBS组相比，PRRSV弱毒苗接种组血清中PRRSV特异性抗体水平升高。其中在阳性疫苗接种组PRRSV特异性抗体一直保持在高水平状态，并且PV+TTR组PRRSV特异性抗体水平略高于PV+CON组。阴性疫苗接种组，在第一次免疫接种后第14、21和49天，V+TTR组PRRSV特异性抗体水平显著高于V+CON组（P<0．05）。血清中和抗体（NA）水平，第一次免疫处理后，PRRSV疫苗接种组血清中PRRSV中和抗体水平较PBS处理组高。疫苗免疫接种组中，第一次免疫接种后第28天，TTR日粮组血清NA水平显著高于CON饲粮组（P<0．05）；在第一次免疫接种后第35天，PV+TTR组血清NA水平显著高于PV+CON组（P<0．05）；在第一次免疫接种后第49天，V+TTR组血清NA水平显著高于V+CON组（P<0．05）。 2、第一次免疫接种后14，28和35天，PRRSV疫苗接种组与PBS处理组相比显著提高血清IFN-γ、IL-10和IL-1β的浓度（P<0．05）。PRRSV疫苗接种组中，在第一次免疫接种后14和28天，饲喂TTR饲粮阳性组血清IFN-γ水平高于CON日粮组；在第一次免疫接种后35天，TTR饲粮阴性组显著提高了血清IFN-γ的水平（P<0．05）。饲喂TTR饲粮的PRRSV疫苗接种组血清中IL-10的浓度下降、血清IL-1β的浓度升高，但差异都不显著。 3、PRRSV疫苗接种组与PBS处理组相比，PRRSV疫苗接种组提高了肺和淋巴结中TLR3mRNA和TLR7mRNA的相对表达量，并且TTR饲粮显著提高了TLR3mRNA和TLR7mRNA的相对表达量。在PRRSV疫苗接种组中，TTR饲粮显著提高了淋巴结中TLR3mRNA、TLR7mRNA的相对表达量（P<0．05）； TTR饲粮显著仅提高了阳性疫苗接种组肺中TLR7mRNA的相对表达量（P<0．05），肺中TLR3mRNA相对表达量也有提高，但差异不显著。 4、在PRRSV疫苗接种组，阳性疫苗接种组出现间质性肺炎，肺泡壁增厚并浸润有脱落细胞、淋巴结损伤；阴性疫苗接种组仅在肺部有不同程度的出血。 结论： 1、添加苏、色氨基酸可提高接种弱毒苗诱导的特异性抗体和中和抗体水平，增强机体的免疫反应。 2、提高饲粮苏氨酸和色氨酸的水平可上调TLR3、7mRNA的表达量，提高了血清IFN-γ水平，说明提高日粮苏氨酸和色氨酸的水平可通过免疫识别激活体液免疫和细胞免疫反应，减缓病毒或疫苗诱导的组织损伤，增强机体的免疫保护作用。

目录

文摘

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声明

前言

1.文献综述

1.1 PRRSV与动物机体的免疫反应

1.2 PRRS疫苗

1.3 营养对PRRSV感染的影响

1.4 苏、色氨酸代谢

1.4.1 苏氨酸的代谢途径

1.4.2 色氨酸的代谢途径

1.5 生长猪对苏、色氨酸的需要量

1.6 免疫应激对动物苏、色氨酸需要量的影响

1.7 苏、色氨酸对生长猪免疫的影响

1.7.1 苏氨酸对生长猪血清中免疫球蛋白的影响

1.7.2 色氨酸对生长猪免疫的影响

1.8 病原模式识别受体-Toll样受体与免疫

1.8.1 PRRSV对TLR3、TLR7 的影响

1.8.2 营养对TLRs表达的影响

2.本研究的目的和意义

3.材料与方法

3.1 试验设计

3.2 疫苗

3.3 试验动物选择及分组

3.4 试验日粮

3.5 饲养管理

3.6 血样采集和屠宰取样

3.6.1 血样采集

3.6.2 屠宰取样

3.7.主要仪器和试剂

3.7.1 主要仪器

3.7.2 试剂及试剂盒

3.7.3 常用试剂的配制

3.8 测定指标及方法

3.8.1 血清PRRSV抗体水平测定

3.8.2 血清免疫球蛋白IgG浓度测定

3.8.3 血清中中和抗体测定

3.8.4 血清免疫细胞因子(IL-1 β、IL-10、IFN-γ)测定

3.8.5 组织PRRSV感染测定(RT-PCR)

3.8.6 组织病理学

3.8.7 肺和淋巴组织中TLR3、TLR7 表达量的测定

3.9.数据处理

4.结果与分析

4.1.临床症状

4.2.TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对体液免疫的影响

4.2.1 TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对PRRSV特异性抗体的影响

4.2.2 TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对血清总IgG的影响

4.2.3.TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对血清PRRSV中和抗体(NA)的影响

4.3.TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对细胞免疫的影响

4.4.TTR日粮接种PRRSV弱毒苗的肺和淋巴结病原式识别受体mRNA表达的影响

4.4.1 肺和淋巴结中TLR3 基因的Real Time PCR

4.4.2 肺和淋巴结中TLR7 基因的Real Time PCR

4.5.TTR日粮对接种PRRSV弱毒苗对组织损伤的影响

5.讨论

5.1.TTR日粮对接种PRRS弱毒苗特异性抗体和中和抗体的影响

5.2.TTR日粮对接种PRRS弱毒苗总IgG的影响

5.3.TTR日粮对接种PRRS弱毒苗细胞免疫的影响

5.4.TTR日粮对接种PRRS弱毒苗肺和淋巴结中TLRs mRNA表达的影响

5.5.TTR日粮对接种PRRS弱毒苗组织病理损伤的影响

结论

参考文献

致谢

附录