猪骨素的酶解及酶解产物的体外抗氧化活性研究

摘要

在我国猪、牛、禽等骨肉的资源非常的丰富，且其中的营养物质含量也很多。大量科学研究表明，骨中含有大量的蛋白质和脂肪；矿质元素比例合理且含量很高；且富含B族维生素还有大脑不可缺乏的磷脂质、磷蛋白和胆碱，以及增强皮下细胞代谢和延缓衰老的骨胶原和软骨素，促进肝功能的蛋氨酸和其它各类氨基酸。因此如今市场上很多企业都开始了对畜禽骨肉的开发利用，猪骨素即是其中的一种重要产品。
　　 本试验采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、动物复合蛋白酶和风味蛋白酶四种不同所用酶的性质和反应条件，对猪骨素进行酶解，通过测定各酶最优条件下的还原能力确定以木瓜蛋白酶作为后续抗氧实验的酶，并研究纯化以后的木瓜蛋白酶酶解物的抗氧化活性，从而希望能够提高利用物的食品质量和营养价值。其主要结果如下：
　　 1.猪骨素酶解条件：
　　 1.1猪骨素酶解对水解度的影响大小：
　　 (1)木瓜蛋白酶酶解猪骨素，各因素对水解度的影响大小为加酶量＞酶解时间＞酶解温度＞pH值＞料液比。
　　 (2)碱性蛋白酶酶解猪骨素，各因素对水解度的影响大小为加酶量＞酶解温度＞料液比＞酶解时间＞pH值。
　　 (3)风味蛋白酶酶解猪骨素，各因素对水解度的影响大小为酶解温度＞酶解时间＞加酶量＞料液比＞pH值。
　　 (4)动物复合蛋白酶酶解猪骨素，各因素对水解度的影响大小为加酶量＞酶解温度＞酶解时间＞pH值＞料液比。
　　 1.2猪骨素酶解对还原能力的影响大小：
　　 (1)木瓜蛋白酶酶解猪骨素，各因素对还原能力的影响大小为酶解温度＞料液比＞pH值＞加酶量＞酶解时间。
　　 (2)碱性蛋白酶酶解猪骨素，各因素对还原能力的影响大小为料液比＞pH值＞温度＞酶解时间＞加酶量。
　　 (3)风味蛋白酶酶解猪骨素，各因素对还原能力的影响大小为料液比＞酶解温度＞pH值＞加酶量＞酶解时间。
　　 (4)动物复合蛋白酶酶解猪骨素，各因素对还原能力的影响大小为酶解温度＞料液比＞pH值＞加酶量＞酶解时间。
　　 运用得出的最佳酶解条件对四种酶进行还原能力测定，其大小为木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞复合蛋白酶，因此选择木瓜蛋白酶酶解液对其进行纯化，然后收集不同肽段，确立其抗氧活性的变化情况，了解其抗氧化作用，为其进一步开发利用提供一定理论依据，得出的结论如下
　　 (1)初步分离
　　 通过对吸收波长和猪骨素酶解样品浓度的比较分析，得到猪骨素木瓜蛋白酶酶解液在浓度为0.50g/mL，流速为0.50mL/min(每5min收集一管)、检测波长258nm和上样体积1.50mL的条件下，洗脱效果较好。
　　 (2)抗氧化性研究
　　 本试验以Vc为阳性对照，通过测定猪骨素柱层析分离纯化吸收峰段(命名为P3和P4)的还原能力、清除羟自由基、清除超氧阴离子和DPPH自由基的能力来判断猪骨素纯化肽段的抗氧化能力。
　　 ①在25.00～200.00μg/mL浓度范围内，其还原能力是Vc＞猪骨素纯化肽段P3＞猪骨素纯化肽段P4＞粗酶液。
　　 ②在清除羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基实验中，根据IC50的大小（即清除率为50.00％的样品浓度）判断清除自由基能力顺序为：Vc＞猪骨素纯化肽段P3＞猪骨素纯化肽段P4＞粗酶液。
　　 ③通过对猪骨素多肽结构的稳定性分析可以得知，温度对于多肽结构的稳定性影响并不明显，而影响其稳定性的主要是pH值。

目录

文摘

英文文摘

1．文献综述

1.1 猪骨素的应用

1.2 猪骨素酶解产物-生物活性肽

1.2.1 生物活性肽的获取

1.2.2 酶法水解简介

1.3 抗氧化活性研究概述

1.3.1 含巯基和羧基小分子的抗氧化机制

1.3.2 生物活性肽的抗氧化机制

1.4 应用进展

1.4.1 动物蛋白酶解物研究进展

1.4.2 猪骨素的酶解研究进展

1.4.3 动物蛋白的抗氧研究进展

1.5 研究目的与意义

2．材料与方法

2.1 实验材料

2.2 仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 蛋白酶活力的测定

2.3.2 猪骨素基本成分测定

2.3.3 氨基态氮含量(AAN)测定

2.3.4 水解度(DH)计算

2.3.5 单酶水解猪骨素最佳工艺条件的确定

2.3.6 猪骨素酶解液的分离纯化

2.3.7 猪骨素生物活性肽体外抗氧活性指标分析

2.3.8 猪骨素多肽结构稳定性分析

3．结果与分析

3.1 蛋白酶的活力测定

3.2 猪骨素基本成分测定

3.3 各种酶水解猪骨素最佳工艺条件的确定

3.3.1 酶解时间的确定

3.3.2 酶解温度的确定

3.3.3 酶解过程中料液比的确定

3.3.4 加酶量对酶解反应的影响

3.3.5 pH值对酶解反应的影响

3.4 各种酶水解猪骨素正交实验结果

3.4.1 木瓜蛋白酶

3.4.2 碱性蛋白酶

3.4.3 风味蛋白酶

3.4.4 复合蛋白酶

3.4.5 正交试验小结

3.5 柱层析初步分离

3.5.1 最佳紫外波长的确定

3.5.2 样品浓度对洗脱效果的影响

3.9 猪骨素多肽抗氧活性测定

3.9.1 还原能力测定

3.9.2 肽含量(peptides content)测定

3.9.3 水解物清除羟自由基活性的测定

3.9.4 邻苯三酚自氧化(清除O2-)法

3.9.5 猪骨素水解液对DPPH自由基的影响

3.10 猪骨素多肽结构稳定性分析

4．讨论

4.1 不同酶酶解猪骨素对其水解度与还原能力的影响

4.2 柱层析分离纯化对样品的影响

4.3 猪骨素酶解液抗氧活性研究

全文结论

问题与展望

参考文献

致谢