PCR-DGGE技术分析乳杆菌多样性及其在攻毒犬与治疗犬肠道内乳杆菌多样性中的应用

摘要

本研究通过特异性引物P1扩增乳杆菌16S rDNA部分序列，结合DGGE技术对断奶幼犬的治疗组与攻毒组进行乳杆菌多样性分析。期望建立一种快速、简单分析乳杆菌多样性的方法并了解健康和腹泻仔犬的乳杆菌变化，为仔犬肠道环境指标和体系的建立、针对断奶仔犬乳杆菌微生态产品开发提供一定的理论依据。本文的主要内容与结果如下：
　　 1.引物P1通过利用BlastPrograms对105种或业种乳杆菌进行比对，发现P1在乳杆菌16SrDNA上677～693区域有高度靶向性；同时又对肠道优势菌群Closditum,Eubact-erium，Bacteroides,Bifidobacterium等进行比对，发现引物P1在这些细菌的16SrDNA存在碱基不匹对。该结果随后通过PCR结合测序结果证明了P1只能扩增乳杆菌。通过对巢式PCR及DGGE条件的优化，建立了利用DGGE技术分析肠道乳杆菌多样性的方法。
　　 2.选取健康幼龄犬16只，分四组，分别为对照组A(芽孢杆菌对照组)、对照组B（空白对照组）、治疗组（沙门杆菌攻毒，芽孢杆菌治疗组）、攻毒组（沙门杆菌攻毒组），每组4个重复，试验期为9d。攻毒试验结果显示：未饲喂芽孢杆菌的攻毒组，4只犬都出现了腹泻，饲喂了芽孢杆菌的治疗组只有一只出现了腹泻现象，对照组无腹泻现象，说明治疗犬与攻毒犬模型建立成功。
　　 3.应用PCR-DGGE分析肠道菌群结果表明：①试验0d各组间DGGE图谱条带相似性都在57％以上，图谱条带组内和各组间都没有显著性差异（P＞0.05），既有相同条带，也不同条带，说明健康仔犬的肠道内乳杆菌大致相同。②对照组A在饲喂的9d过程中，肠道乳杆菌多样性逐步提高，各重复个体共同出现的优势条带增多，说明芽孢杆菌能增大肠道中乳杆菌多样性。从聚类图看出，0d组间相似性66％～88％,3d组间相似性71％～90％，6d组间相似性77％～89％,9d组间相似性62％～74％。说明芽孢杆菌具有稳定肠道乳杆菌的功能。③攻毒组9d乳杆菌多样性下降。说明沙门杆菌能减少肠道内乳杆菌多样性。从组内平均条带数来看，攻毒后条带平均数为5.3，与试验0d相比下降了27.4％，与试验3d和6d相比分别下降了39％，35％。④治疗组在9d乳杆菌多样性出现了下降，平均条带数为7.3，与试验0d相比，平均条带数下降了8％，与试验3d相比下降35.3％，与试验6d相比下降18.9％。由于芽孢杆菌的保护作用，平均条带数多于攻毒组，多样性下降比例明显低于攻毒组。说明芽孢杆菌能增多腹泻犬乳杆菌多样性。
　　 综上断奶仔犬肠道乳杆菌多样性与机体的健康呈正相关，当机体健康时乳杆菌多样性增大，而在腹泻时乳杆菌多样性降低。芽孢杆菌作为微生态制剂，能有效改善肠道乳杆菌的的数量，并稳定其结构。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1. 动物肠道菌群的概述

1.1. 肠道菌群简介

1.2. 肠道菌群分类

1.3. 肠道菌群在肠道中分布

1.4. 肠道菌群的作用

2. 乳杆菌群的概述

2.1. 乳杆菌群的功能

2.2. 乳杆菌群作用机理

3. 研究乳杆菌菌群的方法

3.1. 经典的传统方法

3.2. 研究乳杆菌菌群的新方法

3.3. 变性梯度凝胶电泳

4. 课题研究的目的与意义

第二章 PCR-DGGE技术分析乳杆菌多样性方法的建立

1. 材料

1.1. 菌种

1.2. 培养基

1.3. 试验仪器和主要试剂

2．方法

2.1. 菌种的活化

2.2. 纯菌DNA模板的提取

2.3. 引物的设计

2.4. 引物特异性试验

2.5. 乳杆菌16SrDNA巢式PCR反应条件优化

2.6. DGGE条件优化

3．结果与分析

3.1. 引物特异性比对结果

3.2. PCR验证结果

3.3. 巢式PCR的优化

3.4. DGGE优化结果

4．讨论

4.1. 引物特异性比对结果

4.2. PCR验证性试验

4.3. 该方法的在动物肠道内的应用

4.4. PCR的优化

4.5. DGGE图谱优化

第三章 应用巢式PCR-DGGE技术分析治疗犬与攻毒犬乳杆菌多样性

1．材料

2．试验方法

2.1. 治疗犬与攻毒犬模型的建立

2.2. 粪样DNA模板的提取

2.3. 样品PCR产物的准备

3．结果与分析

3.1. 犬粪样总DNA提取结果

3.2. 样品巢式PCR结果

3.3. 攻毒犬与治疗犬模型的建立结果

3.4. 各组样品PCR-DGGE图谱分析

4．讨论

4.1. 总DNA的提取

4.2. 样品DGGE图谱分析

5．全文结论

参考文献

致谢