胶原基仿生骨基质和纤维蛋白止血敷料的免疫安全性研究

摘要

免疫系统是人体内重要的防御性系统，免疫系统的任何结构改变和功能失调，将使机体免疫抗病能力降低，引起各种感染性疾病、自身免疫性疾病或肿瘤。近年来，生物药品和生物材料新产品层出不穷，而由于新产品添加成分不当而对人体健康产生危害的事例也日渐增多，人们越来越关注生物药品和生物材料的使用安全性。而对其使用安全性评价的一个重要方面即是对生物材料免疫安全性的评价。
　　 本研究选取了两种胶原蛋白类植入性生物材料--胶原基仿生骨基质和纤维蛋白止血敷料，根据相关潜在免疫毒性效应的免疫反应的类型，针对炎症、免疫抑制和免疫刺激3种免疫效应进行研究，设计了大鼠体内埋植实验，研究这两种生物材料是否会对大鼠免疫系统造成影响。主要研究内容及结果如下：
　　 1.选取Wistar大鼠作为实验动物，将胶原基仿生骨基质和羟基磷灰石进行大鼠股骨侧埋植，将纤维蛋白止血敷料、纤维蛋白原和胶原蛋白进行大鼠肝脏埋植，至少暴露28d;选择了适应于实验动物埋植部位的最大埋植量，即胶原基仿生骨基质材料埋植1cm×0.1cm×0.3cm，羟基磷灰石埋植1cm×0.1cm×0.1cm，纤维蛋白止血敷料埋植1cm×1cm×0.4cm，纤维蛋白原埋植1cm×1cm×0.4cm，胶原蛋白埋植1cm×1cm×0.4cm。同时设免疫抑制组（即腹腔注射10mg/mL环磷酰胺）作为阳性对照，假手术组作为阴性对照，将已有的无免疫毒性或低免疫毒性的材料（羟基磷灰石、纤维蛋白原和胶原蛋白）作为平行对照。
　　 2.对大鼠进行症状和体征观察、白细胞、淋巴细胞及中性粒细胞绝对值计数、免疫器官指数分析、免疫器官组织学分析、NK细胞杀伤活力检测、T淋巴细胞亚群分析、巨噬细胞分泌功能检测和血清中免疫球蛋白IgG和IgM的测定，实验结果显示：
　　 (1)腹腔注射10mg/mL环磷酰胺(30mg/kg体重)，连续4天可成功建成大鼠免疫抑制模型。免疫抑制组大鼠出现明显的口鼻黏膜出血、面部肿大；免疫器官出现明显病变；免疫抑制组大鼠白细胞、淋巴细胞及中性粒细胞绝对值计数、免疫器官指数、NK细胞杀伤活力、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α和血清中免疫球蛋白IgG和IgM含量均显著低于阴性对照组（P＜0.05）；
　　 (2)各埋植组（胶原基仿生骨基质、纤维蛋白止血敷料、羟基磷灰石、纤维蛋白原和胶原蛋白埋植）大鼠在术后与阴性对照组相比，进食饮水正常，精神状态良好，伤口愈合良好；体重增加正常，与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）；
　　 (3)各埋植组大鼠白细胞均未见异常减少和增多，白细胞计数与阴性对照组相比无显著差异(P＞0.05）；手术后第2周开始，各埋植组的淋巴细胞绝对值恢复至正常水平，与阴性对照组相比无显著差异（P＞0.05）：
　　 (4)各埋植组大鼠在术后与阴性对照组相比，脾脏指数和肝脏指数均无显著差异(P＞0.05)；
　　 (5)免疫器官病理学切片分析结果表明，各埋植组大鼠在进行手术后与阴性对照组相比，埋植部位组织、脾脏、胸腺和腹腔淋巴结均无病变，结构正常；
　　 (6)各埋植组大鼠在术后与阴性对照组相比，NK细胞杀伤活力无显著性差异(p＞0.05），并且与NK细胞自然死亡率有显著性差异(P＜0.05）；
　　 (7)各埋植组大鼠在术后与阴性对照组相比，除第2周有微弱上升外，CD3+CD4+T淋巴细胞含量、CD3+CD8+T淋巴细胞含量均无大幅变化，整体趋势平稳，CD4+/CD8+比值也没有出现下降，与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05）；
　　 (8)血清中IL-1、IL-6和TNF-α含量与阴性对照组相比血清中IL-1、IL-6和TNF-α含量各埋植组和骨假手术组无明显差异(P＞0.05)；
　　 (9)各埋植组大鼠血清中免疫球蛋白IgG的含量与阴性对照组相比无显著差异(p＞0.05)；大鼠血清中几乎无IgM存在，提示未有新近感染发生。
　　 综合以上实验结果，胶原基仿生骨基质和纤维蛋白止血敷料对大鼠的免疫系统无明显毒性作用，材料具有良好的免疫安全性。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一部分 文献综述

1 生物药品与生物材料的免疫安全性简介及其意义

2 国内外免疫安全性的评价原则

2.1 不同机构对免疫安全性评价的原则

2.2 国际标准化组织(ISO)规定的免疫毒理学试验原则与方法

3 免疫毒理学实验方案初步设计

3.1 实验动物选择及饲养

3.2 实验暴露途径、时间和剂量

3.3 实验中的质量控制

4 新技术新方法的发展应用

4.1 鼠钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)试验

4.2 流式细胞术(flow cytometry，FCM)

4.3 羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)标记

4.4 磁珠分离技术

4.5 免疫表型分析(Immunophenotyping)

4.6 荧光细胞芯片测定法(fluorescent cell chip，FCC)

4.7 自身免疫相关试验新方法

5 植入性医用材料的免疫安全性研究现状

6 本课题的研究目的和意义

第二部分 胶原基仿生骨基质的免疫安全性研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要仪器、试剂与溶液

2.3 方法

2.4 数据处理

3 结果与分析

3.1 症状体征变化

3.2 血常规检测结果

3.3 免疫器官指数分析结果

3.4 免疫器官组织学分析结果

3.5 NK细胞杀伤活力

3.6 T淋巴细胞亚群分析结果

3.7 血清IL-1、IL-6和TNF-α含量

3.8 血清IgG、IgM含量

4 小结

第三部分 纤维蛋白止血敷料的免疫安全性研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要仪器、试剂与溶液

2.3 方法

2.4 数据处理

3 结果与分析

3.1 症状体征变化

3.2 血常规检测结果

3.3 免疫器官指数分析结果

3.4 免疫器官组织学分析结果

3.5 NK细胞杀伤活力

3.6 T淋巴细胞亚群分析结果

3.7 血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量

3.8 血清中IgG和IgM的含量

4 小结

第四部分 讨论

1 实验动物的选择

2 生物材料给药途径、时间和剂量的选择

3 实验方案的制定及相应方法的选择

4 环磷酰胺免疫抑制模型的建立

5 生物材料对动物症状体征、血常规、免疫器官的影响

6 生物材料对NK细胞杀伤活力和T淋巴细胞亚群的影响

7 生物材料对巨噬细胞分泌功能和体液免疫的影响

第五部分 结论

参考文献

致谢