鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗的研制及其免疫原性研究

摘要

以鸭胚尿囊腔途径增殖鸭腺病毒，24-120 h死亡鸭胚和120 h后未死亡鸭胚置4℃冰箱过夜，无菌操作分别收集尿囊液。对鸭腺病毒连续传代，选择传代稳定的鸭胚尿囊液作为种毒，种毒鸭胚半数感染量为10-7.51/0.2 ml，HA价1∶216。用种毒制备疫苗抗原，加0.3％甲醛、37℃灭活48 h，加蜂胶佐剂，制备鸭腺病毒蜂胶灭活苗，蜂胶最终含量10 mg/ml，疫苗安全检验合格。
　　建立了间接ELISA法检测鸭腺病毒抗体。ELISA最佳反应条件为:鸭腺病毒抗原包被浓度2.45μg/ml，血清稀释倍数1∶100，作用时间90 min。HRP-羊抗鸭IgG稀释度为1∶2000。用32份阴性血清测得临界值为0.2310。建立的ELISA方法重复性好，板内变异系数1.09％-2.67％，板间变异系数2.79-4.06％，均小于10％。建立的方法与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、沙门氏菌阳性血清无交叉反应，特异性好。
　　用制备的鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭，以间接ELISA和血凝抑制试验监测免疫鸭抗体消长规律。ELISA结果显示:一次免疫组种鸭免疫后第3d就可在血清中检测到血清呈阳性，第14d时抗体达到峰值(OD=0.628)随后缓慢下降，到免疫后56天仍为阳性;二次免疫组种鸭首免后第7d免疫第二次，共免疫2次，21d到达峰值(0.759)。结果显示:同时间点所测二次免疫组的OD450值显著高于一次免疫组(P＜0.05)，经过二次免疫种鸭的抗体水平更高。免疫组的抗体水平显著高于对照组(P＜0.05)。血凝抑制试验结果显示:一免后第3d时可以检测到抗体效价，值为23.83。在免疫后的3 d-14d抗体上升的最快，并达到最大值211.52，然后开始缓慢下降，到免疫后56 d抗体效价任保持在29.38的较高水平。在首免后第7d进行二次免疫，结果显示，在首免后第21d达到峰值，效价高达216。以后缓慢下降，56 d时的抗体效价为213.30。在测定的整个过程，同时间点二次免疫组的抗体水平都高于一次免疫组，两个实验组的抗体水平都显著高于生理盐水对照组。ELISA法的敏感性高于血凝抑制试验方法，两者呈平行关系。
　　用制备的鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭，以MTT法和白细胞吞噬试验监测免疫鸭细胞免疫应答。MTT法检测鸭外周血淋巴细胞转化活性结果显示:一次免疫组在免疫后第3d检测发现T淋巴细胞对ConA反应增强，且显著高于对照组(P＜0.05)。到第10d到达峰值，然后快速下降。二次免疫组在首免后10-14 d，T淋巴细胞转化活性最高，随后逐渐下降。在本实验的整个测定过程中，在首免后第10d、14d、21 d、28 d二次免疫组的转化率显著高于一次免疫组(P＜0.05)和对照组(P＜0.05)，在42 d时两个试验组和对照组差异均不显著。白细胞吞噬试验结果显示:一次免疫组白细胞吞噬指数在免疫后21 d达到最大值，吞噬指数为3.03，然后快速下降。二次免疫组白细胞吞噬指数一直大于一次免疫组和对照组，并且在首免后21 d到达最大值。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 鸭腺病毒研究现状

1．1 鸭腺病毒在腺病毒中的分类地位

1．2 鸭腺病毒的形态结构

1．3 鸭腺病毒基因组结构和功能

1．4 鸭腺病毒理化性质

1．5 鸭腺病毒感染禽类引起的疾病

1．6 检测鸭腺病毒感染的方法

2 蜂胶及其应用

2．1 蜂胶

2．2 蜂胶佐剂的应用

3 选题目的

第二章 鸭腺病毒蜂胶灭活苗的研制及其免疫原性研究

1 试验材料

1．1 试验毒株

1．2 参考毒(菌)株

1．3 试验动物

1．4 主要试验试剂及配方

1．5 试验仪器

1．6 其他试验材料

2 试验方法

2．1 研制鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗

2．2 检测鸭腺病毒抗体的间接ELISA方法的建立

2．3 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫种鸭及免疫应答监测

3 试验结果

3．1 研制鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗

3．2 检测鸭腺病毒抗体的间接ELISA方法的建立

3．3 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫种鸭及免疫应答监测

4 讨论

4．1 疫苗的研制

4．2 间接ELISA方法的建立

4．3 疫苗对种鸭体液免疫的影响

4．4 疫苗对种鸭细胞免疫的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文