化学杂交剂“化杀灵”诱导甘蓝型油菜雄性败育的作用特征及遗传特性研究

摘要

油菜是世界重要油料作物之一，我国种植面积和总产量均居世界首位。杂种优势是生物界的普遍现象，具有重要的理论研究价值和广阔的应用前景。在油菜杂种优势利用不同方式中，理论上最容易实现育种目标的首推化学剂诱导雄性败育类型。本研究以甘蓝型油菜品种（系）9313B和R121等为研究材料，围绕化学杂交剂化杀灵诱导油菜雄性败育展开研究。主要研究内容和结果如下:
　　1.化学杂交剂化杀灵诱导油菜雄性败育的主要作用特征
　　以4个甘蓝型油菜品种（系）(R121、9313A、9313B、leyou5)为研究对象，用化学杂交剂化杀灵溶液的5个浓度在小孢子时期进行叶面处理，分别测定了叶片和花蕾中SOD、POD、CAT活性，叶片谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性，叶片叶绿素含量，并对花朵形态特征、育性及主要经济性状变化进行调查，对R121(Tr)和9313B(Tr)进行雄性败育的细胞学显微观察。研究表明:(1)植株生长发育均受到不同程度的抑制，雄性败育株雄蕊退化、花药空瘪。(2)2次喷药均能使4个品种（系）产生95-100％雄性败育率，4个品种（系）第1次最适浓度在0.07 g/L-0.21 g/L之间，用药量8-10mL/株。(3)4个品种（系）叶片中SOD、CAT活性均持续上升;叶片POD活性一直低于对照但整体均维持在较高水平。花蕾SOD、CAT活性均持续下降;花蕾POD活性均高于对照，除R121外均先升后降。总之，三种酶在活性氧代谢过程的不协调是雄性败育的重要特征之一。(4) GSTs活性呈现下降趋势，叶片和花蕾中的GSTs相对活性均小于1，9313B前期下降幅度较小而后期上升幅度较大。GSTs代谢能力差异是品种敏感性差异的又一重要原因。(5)叶片叶绿素含量均有不同程度的下降，不同材料间变化幅度差异较大，下降幅度与敏感性呈正相关关系。(6)石蜡切片观察发现，从花粉母细胞时期开始便出现各种发育差异，主要表现在花粉母细胞发育异常，绒毡层发育异常和小孢子发育异常三个方面。R121(Tr)主要败育时期为花粉母细胞时期，9313B(Tr)主要败育时期为小孢子时期。
　　2.甘蓝型油菜对化杀灵敏感性的生物测定
　　以36个甘蓝型油菜品种（系）为研究材料，用不同浓度化杀灵溶液分别在种子发芽12h、盆栽5叶期、大田种植5叶期、大田种植“平头”期进行处理，对种子初生根长、盆栽油菜主要性状、大田油菜主要性状分别进行测定。获得如下研究结果:(1)筛选出对化杀灵弱敏感品种（系）3个，强敏感品种（系）6个，中度敏感品种（系）27个。(2)用化杀灵溶液处理催芽12h的油菜种子，72h后测量初生根长，初生根长的IC50值和敏感指数值能够较好反映品种（系）对化杀灵的敏感性差异。(3)叶片药害指数、叶片减少率、茎叶夹角增加率、处理后14日地上部分鲜重减少率这4个指标间存在极显著正相关关系，相关系数(R)达到0.8125-0.9807。可作为油菜苗期对化杀灵敏感性差异的鉴定指标。(4)处理后第4d，8d，12d的叶绿素减少率与第14天地上部分鲜重减少率均呈极显著正相关，相关系数(R)达到0.8462-0.8761，因此可以用第4天的叶绿素减少率作为不同品种（系）对化杀灵敏感性的早期评价指标之一。(5)油菜对化杀灵敏感性可以从种子、苗期、花期三个时段进行评价和筛选。种子发芽处理后第72h初生根长半抑制率(IC50)、5叶期处理后第14天地上部分鲜重半抑制率(ID50)、花期雄性不育率和雌性可育率作为敏感性差异的常规评价指标，苗期叶绿素含量的变化可以作为对常规评价体系的补充。
　　3.甘蓝型油菜对化杀灵敏感性的遗传
　　以化杀灵强敏感的甘蓝型油菜纯系R121(P1)作母本，弱敏感的纯系9313B(P2)作父本，配制六个遗传世代及反交F1(RF1)杂种。以花器形态特征结合镜检花粉量对花朵败育敏感性分级，每株油菜从初花起连续调查前30朵花的敏感性，统计每株油菜的雄性败育敏感性，利用质量性状分析方法和“主基因+多基因”质量-数量性状遗传模型进行分析。本研究表明:(1)化杀灵诱导的雄性败育敏感性与细胞质无关;(2)化杀灵诱导的雄性败育敏感性性状属于数量性状，该模型为两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因遗传模型，该性状主要由2对主基因控制。(3)该性状遗传上以主基因效应为主，多基因具有一定的作用，受环境影响较小。该性状的主基因遗传率均远高于多基因遗传率，主基因对后代的雄性败育敏感性表现具有极大的影响。
　　4.化杀灵敏感性与油菜ALS和MF6基因的关系
　　以高敏感的甘蓝型油菜纯系R121、弱敏感的纯系9313B、中度敏感的中双4号ALS1、ALS3、MF6基因序列为研究对象，克隆并分析了三种类型之间基因序列的异同，对相应氨基酸和蛋白质结构与功能进行预测。本研究表明:(1)9313B、中双4号、R121的ALS3基因序列相似，通过NCBI数据库预测的氨基酸和蛋白质序列和结构也相同;R121的ALS1部分核苷酸缺失以及第833位核苷酸位点插入一个G，致使第835位到第837位核苷酸形成一个终止密码TAG是其对化杀灵表现强敏感性的重要原因。(2)9313B、中双4号、R121的MF6基因均为2个拷贝，分别是MF6.1和MF6.2。三份材料MF6.1基因序列相似，氨基酸和蛋白质预测结构也相同;9313B的MF6.2核苷酸序列第372位点G突变为A，并与前两位的核苷酸形成一个终止密码TGA，这可能是9313B(Tr)雄性败育时期较R121(Tr)和中双4号(Tr)晚，且所需要化杀灵浓度较高的重要原因。

目录

声明

摘要

ABBREVIATION

第一章 文献综述

1．油菜杂种优势利用现状

2．油菜雄性不育主要类型及优缺点

2．1 细胞质雄性不育

2．2 细胞核雄性不育

2．3 复合型雄性不育

2．4 转基因雄性不育

2．5 化学杂交剂诱导雄性败育

3．化学杂交育(制)种研究进展

3．1 油菜化学杂交剂研究的历史、现状及前景

3．2 化学杂交剂诱导油菜雄性败育处理方法的研究

3．3 化学杂交剂诱导油菜雄性败育特征的研究

3．4．国内油菜雄性不育利用前景展望

4．植物对化学除草剂敏感性的研究进展

4．1 化学除草剂研究进展

4．2 植物对除草剂敏感性的生物测定

4．3 植物对除草剂抗性的遗传机理

5．化杀灵诱导雄性败育相关酶及基因研究进展

5．1 乙酰乳酸合成酶及基因研究

5．2 多聚半乳糖醛酸酶及基因研究

6．本研究的主要内容、目的与意义

6．1 研究主要内容及目的

6．2 研究意义

第二章 化杀灵诱导油菜雄性败育的作用特征

1．前言

2．材料与方法

2．1 供试材料与药剂

2．2 药剂处理方式

2．3 油菜育性及主要经济性状调查

2．4 油菜雄性败育的细胞学观察

2．5 保护酶的活性测定

2．6 谷胱甘肽S-转移酶活性测定

2．7 叶绿素含量测定

3．结果与分析

3．1 化杀灵诱导油菜雄性败育的花器特征

3．2 化杀灵诱导油菜雄性不育的效果

3．3 化杀灵对油菜保护酶活性的影响

3．4 化杀灵对不同品种叶片GSTs活性的影响

3．5 化杀灵对不同品种叶绿素含量的影响

3．6 化杀灵对油菜诱导雄性败育的细胞学影响

4．讨论

4．1 化杀灵处理时期、处理剂量对品种败育效果的影响

4．2 甘蓝型油菜生长发育对化杀灵的响应

4．3 化杀灵处理时期对雄性败育时期的影响

4．4 甘化杀灵诱导蓝型油菜雄性败育的细胞学特征

4．5 甘蓝型油菜保护酶活性对化杀灵的响应

4．6 化杀灵对甘蓝型油菜谷胱甘肽-转移酶GSTs的影响

4．7 化杀灵对甘蓝型油菜光合作用的影响

第三章 化杀灵诱导油菜雄性败育敏感性的生物测定

1 前言

2 化杀灵对油莱种子初生根长的影响

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 数据处理

3 化杀灵对油菜主要性状的影响

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．3 数据处理

4 结果与分析

4．1 化杀灵对种子初生根长的影响

4．2 化杀灵对甘蓝型油菜品种(系)主要性状的影响

5 讨论

5．1 油菜对化杀灵敏感性鉴定的方法及结果

5．2 油菜对化杀灵敏感性筛选和评价的技术指标

5．3 化杀灵诱导油菜雄性败育遗传的稳定性及鉴定

5．4 化杀灵抗(耐)种源的筛选和创新

5．5 化杀灵敏感性育种亲本的筛选流程设计

第四章 化杀灵诱导油菜雄性败育敏感性的遗传

1．前言

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 花器形态比较

3．2 亲本间差异显著性检验

3．3 六个世代的雄性败育敏感性变异次数分布

3．4 化杀灵诱导的雄性败育敏感性性状的主基因+多基因遗传分析

4 讨论

4．1 化杀灵诱导雄性败育敏感性性状的遗传

4．2 化学杂交剂诱导的雄性败育与生态型雄性不育

第五章 化杀灵作用相关油菜基因ALS、MF6的克隆与分析

1．前言

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 实验方法

3．结果与分析

3．1 DNA提取结果

3．2 ALS基因的克隆与分析

3．3 MF6基因的克隆与分析

4．讨论

4．1 ALS和MF6基因的克隆

4．2 ALS基因型差异对化杀灵敏感性的影响

4．3 甘蓝型油菜MF6基因及蛋白质结构

第六章 全文结论与创新点

1．主要研究结论

1．1 化杀灵诱导油菜雄性败育的主要作用特征

1．2 甘蓝型油菜对化杀灵敏感性的生物测定方法

1．3 甘蓝型油菜对化杀灵敏感性的遗传规律

1．4 化杀灵敏感性与ALS基因的关系

1．5 化杀灵敏感性与MF6基因的关系

1．6 化杀灵诱导雄性败育敏感性的可能机理

2．主要创新点

2．1 甘蓝型油菜对化杀灵敏感性的生物测定与评价指标体系

2．2 甘蓝型油菜对化杀灵敏感性性状的遗传规律

2．3 油菜对化杀灵敏感性与ALS和MF6基因的关系

3．值得进一步研究的问题

3．1 化杀灵诱导的雄性败育敏感基因与遗传性雄性不育基因的相互关系

3．2 化杀灵诱导的甘蓝型油菜敏感性基因的定位与分析

3．3 R121纯系ALS1基因的研究

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的部分学术论文及主要获奖目录