酿酒酵母糠醛耐受关键转录调控基因的筛选及其被调控基因的转录分析

摘要

燃料乙醇，因其具有清洁、环保以及可再生性等诸多优点，被公认为是最具发展前景的石油替代能源。木质纤维素（包括农作物秸秆、林业副产物以及城市垃圾等）是地球上分布最为广泛、产量最为丰富的可再生资源，是燃料乙醇生产的最佳原料来源。以木质纤维素为原料生产燃料乙醇首先要经过稀酸或碱预处理，将其水解成单糖后才能被酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵生成乙醇。在此过程中，不可避免地会产生对酿酒酵母有强烈抑制作用的有毒副产物，其中，糠醛是最为关键的一种。已有研究发现:在糠醛应激状态下，酿酒酵母会提高约300个左右功能基因的表达来增强其脱毒和耐受能力，并对影响这些基因表达的转录调控基因进行了初步预测和分析。
　　本论文研究根据转录调控基因的功能分类，选择了23个可能与糠醛脱毒和耐受相关的转录调控基因为研究对象，以单倍体酿酒酵母实验菌株BY4742为实验材料和表达宿主菌，首先对用于表达这些基因的启动子进行了筛选;然后用筛选出的启动子对转录调控基因进行了基因工程重组表达，研究了表达菌株对糠醛的耐受表型差异，对关键转录调控基因进行了筛选;最后对它们所调控的下游基因进行了转录分析，获得了以下结果:
　　(1)以关键转录调控基因YAP1为代表基因，采用常用的酿酒酵母高效表达启动子ADH1p、HXT1p、PGK1p、PDC1p、TEF1p、TDH1p和TPI1p以及糠醛诱导表达启动子ADH7p构建了在不同启动子控制下表达YAP1的重组质粒，并成功导入酿酒酵母菌株BY4742获得了基因工程重组菌株，开展了重组菌株对糠醛的耐受表型研究及比较分析。结果发现:与原始菌株相比，重组菌株对糠醛的耐受能力显著增强，表现在迟滞期缩短，较早恢复正常生长进入对数生长期，其中以TEF1p、ADH7p和PGK1p等3个启动子构建的重组菌株效果较好。
　　(2)以筛选出的TEF1p(PGK1p)、ADH7p为启动子，对余下的22个转录调控基因分别进行了重组表达质粒的构建，并成功导入酿酒酵母菌株BY4742获得了各转录调控基因的基因工程重组菌株，开展了重组菌株对糠醛的耐受表型研究及比较分析。结果发现:在以ADH7p作为启动子构建的酿酒酵母重组菌中，YAP1、MSN2、PDR3、RDS1、AFT1等来自不同家族基因的重组菌比其他基因重组菌对糠醛应激表现出较短的迟滞期，具有较强的耐受能力;其中以MSN2基因的重组菌(AM01)表现出更明显的优势。在以TEF1p作为启动子构建的酿酒酵母重组菌中，同样分析发现:YAP1、AFT1、PDR1、RPN4、RDS1等来自不同家族基因的重组菌比其他基因重组菌对糠醛应激表现出较短的迟滞期，具有较强的耐受能力;其中以RDS1基因的重组菌(TR01)能在糠醛应激状态下更快恢复生长，耐受能力最强。
　　(3)以AM01和PR01酿酒酵母基因工程重组菌株为研究对象，采用荧光实时定量PCR技术对转录调控基因MSN2和RDS1以及它们所调控的下游代表基因在糠醛应激下的转录变化进行了定量分析。结果发现:MSN2和RDS1基因的转录受到外源启动子的调控，转录水平显著高于对照菌株BY4742，分别提高12.7和3.8倍;并相应地提高了被调控基因的转录水平，有些基因的转录水平提高了30倍以上。
　　本论文研究成功构建了23个糠醛耐受关键转录因子的重组酵母菌株，并研究分析了其耐受性，从中筛选出了糠醛耐受关键转录调控基因。本论文研究取得的成果使我们对酿酒酵母对呋喃醛脱毒及耐受的机理有了更深入的认识，筛选出的关键转录调控基因为今后不同功能转录调控基因的联合表达及后续深入研究奠定基础，对实现木质纤维素燃料乙醇的工业化生产具有重要的科学及实践意义。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 木质纤维素预处理过程中的抑制剂

1．2．1 木质纤维素的预处理

1．2．2 抑制剂的产生及其代谢途径

1．2．3 抑制剂对酵母菌的影响及脱毒

1．3 酿酒酵母对抑制剂的耐受研究

1．3．1 酿酒酵母对抑制剂的响应

1．3．2 酿酒酵母对抑制剂的耐受脱毒机理

1．3．3 酿酒酵母糠醛耐受调控因子研究

1．4 提高酿酒酵母的耐受性

1．5 研究的内容及目的意义

1．6 技术路线

第二章 酿酒酵母糠醛耐受关键转录调控基因表达的启动子的筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂及仪器

2．1．4 PCR引物设计

2．1．5 DNA及质粒DNA提取

2．1．6 PCR扩增

2．1．7 重组酵母表达质粒的构建

2．1．8 醋酸锂法转化酿酒酵母

2．1．9 对糠醛的应答分析

2．2 结果与分析

2．2．1 目的基因片段的获得

2．2．2 重组酵母表达载体的构建

2．2．3 酿酒酵母重组菌株的构建

2．2．4 对糠醛的应答分析

2．3 讨论

第三章 酿酒酵母糠醛耐受关键转录调控基因的筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株及质粒

3．1．2 培养基

3．1．3 主要试剂及仪器

3．1．4 PCR引物设计

3．1．5 DNA及质粒DNA提取

3．1．6 PCR扩增

3．1．7 重组酵母表达质粒的构建

3．1．8 醋酸锂法转化酿酒酵母

3．1．9 对糠醛的应答分析

3．2 结果与分析

3．2．1 目标基因片段的获取

3．2．2 重组酵母表达载体的构建

3．2．3 酿酒酵母重组菌株的构建

3．2．4 对糠醛的应答分析

3．3 讨论

第四章 酿酒酵母糠醛耐受转录因子调控的基因转录分析

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 主要试剂及仪器

4．1．3 qPCR引物设计

4．1．4 RNA提取及cDNA的制备

4．1．5 基因表达qRT-PCR分析

4．2 结果与分析

4．2．1 样品RNA的获得

4．2．2 基因表达qRT-PCR分析

4．3 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间取得的研究成果