抗无乳链球菌中药的筛选及盐酸小檗碱抗无乳链球菌作用机理的初步研究

摘要

无乳链球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一，患有乳房炎的奶牛会影响牛奶的产量和品质，目前奶牛乳房炎的主要治疗手段是使用抗生素疗法，但抗生素易使细菌产生耐药性，影响治疗效果。中草药具有不易产生耐药性、高效低毒、低残留的优势。因此本研究对20味中药的有效成分进行提取，筛选出抗无乳链球菌最优的中药，对其单味中药进行提取工艺的优化，在最佳提取工艺条件下，研究黄连提取物对引致奶牛乳房炎的主要致病菌的体外抑菌活性，然后以抑菌效果最优的中药有效成分的单体物质为研究对象，进行抗无乳链球菌的抑菌机理的初步研究。主要研究内容如下:
　　1、抗无乳链球菌中药的筛选:采用乙醇回流法和超声波法提取20味中药的有效成分，测定黄连等20味中药提取物对无乳链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。20味中药提取物的体外抗菌活性结果表明:黄连、虎杖、地榆和黄芩4味中药提取物的MIC值和MBC值范围为7.8mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、乌梅、茵陈、秦皮、艾叶和紫花地丁6味中药提取物的MIC值范围为31.25mg/mL～62.5mg/mL，MBC值范围为62.5mg/mL～125mg/mL;黄柏、鱼腥草和白头翁3味中药提取物的MIC值和MBC值均为125mg/mL;苦参、金银花、穿心莲、杜仲、连翘、夏枯草和何首乌7味中药提取物的MIC值和MBC值范围为250mg/mL～500mg/mL。
　　结论:筛选出黄连提取物对无乳链球菌具有最好的体外抑菌效果。
　　2、黄连抗无乳链球菌的最优提取工艺及体外抑菌活性研究:采用正交设计，以浸膏得率及对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)值和最低杀菌浓度(MBC)为指标，对黄连提取工艺条件进行优选研究，在黄连的最佳提取工艺条件下，测定黄连提取物对奶牛乳房炎的主要致病菌即无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工艺结果表明，黄连的最佳提取工艺为料液比1∶8，80％乙醇浓度回流提取2次，每次1.5h。黄连体外抑菌活性实验结果表明，黄连提取物对无乳链球菌的MIC值和MBC值均为3.9mg/mL，对大肠杆菌的MIC值和MBC值分别为62.5mg/mL和125mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值均为31.25mg/mL。
　　结论:在最佳提取工艺下的黄连提取物抑菌效果提高，且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。
　　3、盐酸小檗碱对无乳链球菌形态结构及乳酸脱氢酶活性的影响:利用平板稀释法绘制出盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线，通过透射电子显微镜观察盐酸小檗碱对无乳链球菌超微结构的影响，测定乳酸脱氢酶(LDH)活力研究盐酸小檗碱对无乳链球菌酶活性的影响。抑菌曲线结果表明，在MIC浓度下，盐酸小檗碱能够抑制细菌的生长;在2MIC浓度下，盐酸小檗碱能在4h内将细菌全部杀死。透射电镜结果表明，正常组无乳链球菌细胞结构清晰完整，从内到外可见层次分明的核区，细胞膜和细胞壁。在盐酸小檗碱的作用下，细胞形状变得不规则，细胞膜、细胞壁逐渐溶解，膜壁界限变得模糊，细胞质严重外流，核区不清晰，细胞质解体内出现空腔。测定酶活力实验结果表明，经过药物作用后，乳酸脱氢酶活力下降。
　　结论:盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线呈现了浓度时间的相关性。盐酸小檗碱对无乳链球菌的结构有较强的破坏作用，随着时间的延长破坏加剧，且可以降低乳酸脱氢酶的活性。
　　4、盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响:通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)核酸荧光染色法研究盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响。SDS-PAGE结果表明，正常无乳链球菌蛋白谱带多且清晰，而经药物作用后，蛋白谱带变浅，有的谱带甚至消失;DAPI染色实验结果表明，正常无乳链球菌DNA荧光强度较强，且荧光点较多，经过药物作用后DNA荧光强度明显减弱。
　　结论:盐酸小檗碱可以影响蛋白质和DNA的合成。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述及研究目的意义

1 文献综述

1．1 无乳链球菌研究概况

1．2 奶牛乳房炎的防治现状

1．3 天然药物抗菌研究进展

1．4 天然药物中抗菌有效成分的研究进展

1．5 天然药物抗菌机理的研究进展

1．6 黄连及盐酸小檗碱研究进展

2 研究目的与意义

第二章 抗无乳链球菌中药的筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 20味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性研究

3 讨论

第三章 黄连抗无乳链球菌的提取工艺及体外抑菌活性研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 黄连最佳提取工艺的优选

2．2 最佳提取工艺下黄连对3种细菌的体外抑菌活性研究

3 讨论

第四章 盐酸小檗碱对无乳链球菌形态结构及乳酸脱氢酶活性的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 盐酸小檗碱对无乳链球菌的MIC

2．2 盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线

2．3 盐酸小檗碱对无乳链球菌超微结构的影响

2．4 盐酸小檗碱对无乳链球菌LDH的影响

3 讨论

第五章 盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳结果

2．2 盐酸小檗碱对无乳链球菌DNA荧光强度变化的影响

3 讨论

第六章 结论与创新

1 结论

2 创新

参考文献

致谢

附图

攻读学位期间发表的学术论文