中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和组织表达分析

摘要

Sox(SRY-box containing)基因在动物界广泛存在，目前已在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物中发现超过100个成员，根据HMG盒的相似性，将其划分为A-K11个亚族。Sox4基因是SoxC亚族成员之一，在胚胎发育中起着至关重要的作用，主要参与心脏、淋巴细胞、中枢神经系统、内分泌胰岛、造血细胞、性腺等多种器官的发育。Sox7基因属于Sox家族F亚族，主要参与胚胎发育和细胞命运的决定。Sox7基因不仅能够诱导Nodal信号分子、中胚层相关基因以及内胚层分化基因的表达，而且是内胚层Veg-T信号途径所需的标志物。本研究以中国特有的大型珍稀二级保护物种，唯一尚存的隐鳃鲵科两栖动物-中国大鲵(Andrias davidianus)为研究对象，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得中国大鲵Sox4基因的3个同系物:Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因的cDNA序列，对其进行生物信息学分析，并通过荧光定量PCR技术进行各组织间表达情况的分析，主要取得如下结果:
　　1.Sox4a基因的cDNA序列为1153bp，编码224个氨基酸，位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区，同源性分析表明中国大鲵Sox4a编码蛋白与其他物种Sox4a蛋白同源性在63.8％～97.2％之间;对不同物种的Sox4a蛋白构建系统发育树可知:鲤鱼(Cyprinus carpio)与施氏鲟(Acipenser schrenckii)从进化树最先分出，随后两栖类的中国大鲵与饰纹姬蛙(Microhyla ornata)聚成一支，鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)与斑马鱼(Danio rerio)最后分出，说明Sox4a基因是一个古老的基因，且从中国大鲵到鱼类的进化速度比较快，Sox4a基因的基因复制时间可能在鳙鱼与斑马鱼分化之前。Sox4b基因的cDNA序列为1058 bp，编码193个氨基酸，位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区，同源性分析表明中国大鲵Sox4b编码蛋白与其他物种Sox4b蛋白同源性在60.3％～97.1％之间;对不同物种的Sox4b蛋白构建系统发育树可知饰纹姬蛙最早从进化树分出，随后是鲤鱼、瓣结鱼(Folifer brevifilis)等几种鱼类，中国大鲵与金线蛙(Pelophylax plancyi)聚成一支最后从进化树分出。Sox4c基因的cDNA序列为996bp，编码149个氨基酸，位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区，Sox4c基因目前仅在饰纹姬蛙获得部分核苷酸片段，将其推导蛋白与中国大鲵Sox4c序列进行比对，两者同源性高达81.7％。
　　2.Sox7基因的cDNA序列长为847bp，编码188个氨基酸，位于44-115之间的HMG-box是其主要功能区，中国大鲵Sox7编码蛋白与其他物种Sox7蛋白同源性在64.1％～76.8％之间;对不同物种的Sox7蛋白构建系统发育树可知Sox7基因是一个比较古老的基因，在鱼类、两栖、爬行、哺乳均有存在，中国大鲵与非洲爪蟾、热带爪蟾两栖类聚在一起基本符合物种进化的历程。
　　3.从NCBI下载、查阅文献及本实验室先前所得的中国大鲵Sox基因家族:Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox4c、Sox7、Sox9、Sox11、Sox14a、Sox14b、Sox19共11个成员。利用MEGA5.0软件，采用邻接法(Neighbor-joining method)重复1000次对这11个Sox基因成员构建系统发育树，结果显示:Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox11汇聚在一起分化出来，显示其较原始的进化地位、Sox9及Sox7聚在一起随后分出，Sox14的2个同系物、Sox2、Sox19及Sox3最后分出。
　　4.利用荧光定量PCR方法分析中国大鲵Sox4和Sox7基因的组织表达情况，结果显示:Sox4基因在性成熟的中国大鲵各组织表达量均比较低，相对而言在肠道表达量最高，心脏、卵巢、垂体的表达量次之，肝脏中的表达量极低，脑及肾脏中几乎不表达。Sox7基因在所有检测的组织中均有表达，且在肾脏中的表达量最高，肠道、心脏、脑以及卵巢的表达量次之，垂体中的表达量较低，肝脏表达量极低。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 Sox基因的概述

1．2 Sox基因的成员与鉴定

1．3 Sox基因超家族的特点

1．4 Sox基因家族分类及功能

1．5 Sox基因超家族的进化

1．6 Sox4和Sox7基因的研究进展

1．6．1 Sox4基因及其同系物的研究进展

1．6．2 Sox7基因的研究进展

1．7 研究目的及意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验仪器

2．1．3 试剂及主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 中国大鲵总RNA的提取

2．2．2 第一链cDNA的合成

2．2．3 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因保守片段的克隆

2．2．4 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因5'-RACE扩增

2．2．5 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因3'-RACE扩增

2．2．6 序列分析

2．2．7 荧光定量PCR检测中国大鲵Sox4和Sox7基因在各组织中的表达

3 结果与分析

3．1 中国大鲵总RNA的提取

3．2 中国大鲵Sox4基因同系物保守片段的克隆

3．3 中国大鲵Sox4基因同系物cDNA的克隆及序列分析

3．3．1 中国大鲵Sox4基因同系物cDNA的克隆

3．3．2 Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析

3．3．3 Sox4同系物蛋白序列比对、同源性分析及系统进化树的构建

3．4 中国大鲵Sox7基因cDNA的克隆及序列分析

3．4．1 Sox7基因的cDNA的克隆

3．4．2 Sox7基因的序列分析

3．4．3 Sox7蛋白序列比对、同源性分析及系统进化树的构建

3．5 Sox基因超家族进化关系

3．6 中国大鲵Sox4和Sox7基因的组织表达分析

3．6．1 荧光定量PCR检测

3．6．2 中国大鲵Sox4基因各组织的差异表达结果

3．6．3 中国大鲵Sox7基因各组织的差异表达结果

4 讨论

4．1 中国大鲵Sox4同系物及Sox7基因的序列分析

4．1．1 中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析

4．1．2 中国大鲵Sox7基因的序列分析

4．2 Sox基因超家族进化关系分析

4．3 中国大鲵Sox4、Sox7基因在各组织中的表达分析

4．3．1 中国大鲵Sox4基因在各组织中的表达分析

4．3．2 中国大鲵Sox7基因在各组织中的表达分析

5 结论

参考文献

致谢

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