耐盐植物盐芥吸钾排钠的生理机制及基因调控网络研究

摘要

土壤盐渍化(soil salinization/salination)或者盐胁迫(salt stress)是使农业作物的产量降低或者作物不能生长的现象，土壤盐渍化影响植物的生理生化指标，如抑制种子萌发率、破坏离子平衡（如Na+/K+平衡）、细胞功能、抑制植株高度、干重、产量、改变糖和氨基酸等代谢物质含量、抗氧化物酶活性等，影响着农作物的产量和品质，因此盐渍化正严重限制着我国乃至世界的农作物产量提升及农业经济发展。Na/K+失衡是土壤盐渍化最明显的表现之一，土壤盐渍化导致的Na+/K+失衡破坏植物体内原有的离子平衡，因而破坏Na+、K+各自所参与的代谢，如维护细胞膜电位、调控酶活性等。本研究通过对拟南芥哥伦比亚型（Arabidopsis haliana，Columbia，Col）、高水杨酸生态型(Cape Verde Islands，Cvi-0)、抗盐胁迫能力较强的盐芥（Thellungiellasalsuginea，盐芥）和低水杨酸的NahG转基因植物为实验材料，采用盐胁迫(100 mMNaCl)、水杨酸(SA，0.5 mM)和SA的抑制剂多效唑(PBZ，0.5 mM)预处理、结合消减杂交以及转录组测序等技术手段探究盐芥吸钾排钠—耐盐胁迫的生理机制，以及水杨酸在其中起到的关键作用。本文得到的主要结果如下:
　　(1)缺乏水杨酸的植物耐盐胁迫，但并非通过吸钾排钠的生理机制
　　利用哥伦比亚型Col、高水杨酸生态型Cvi-0和NahG转基因材料为实验材料，分别用100 mM Na+和100 mM K+胁迫处理拟南芥，并检测盐胁迫对叶面积（第3片真叶）、叶片数、植株含水量、植株鲜重、Na+、K+含量的影响，结果显示100 mM Na+和100 mM K+胁迫后，三个品种中叶面积、叶片数、植株含水量、鲜重都有不同程度的下降，并且100 mM Na+处理显著增加植株Na+含量(p＜0.01)，降低K+含量(p＜0.05)，而100 mM K+胁迫后，植株体内K+含量升高(p＜0.01)，Na+含量降低(p＜0.05)。比较哥伦比亚型Col、生态型Cvi-0和NahG转基因材料中以上指标的变化程度，显示NahG中的生理生化指标受盐胁迫的影响程度最小，表明NahG转基因材料的抗盐胁迫能力较强。但NahG转基因植物耐盐并非通过吸钾排钠的生理机制，其K+含量与Col并无显著差异，推测其耐盐机制可能与其抗氧化能力较强有关。
　　(2)水杨酸通过促进吸钾排钠提高植物的耐盐性
　　以拟南芥和盐芥为实验材料，分别用0.5 mM SA和0.5 mM PBZ预处理后，再用100 mM NaCl胁迫处理，检测植株含水量、Na+、K+含量，活性氧检测（H202染色法）、可溶性糖浓度、丙二醛(MDA)含量、电导率的变化。结果显示SA处理使盐胁迫导致的植株含水量下降幅度减缓(p＜0.05)。盐胁迫还造成可溶性糖浓度下降(p＜0.05)、MDA含量上升(p＜0.05)、电导率上升(p＜0.01)、活性氧含量升高。而这些参数在SA处理下变化幅度减小，表明SA处理后植株的抗盐胁迫能力增强。而PBZ预处理可部分逆转SA的作用。SA处理能够显著缓解盐胁迫下的Na+含量上升(p＜0.05)，同时促进K+吸收(p＜0.05)，而PBZ抑制SA的作用，所以SA缓解盐胁迫的机制与其“吸钾排钠”作用有关。
　　盐芥本身对盐胁迫有很强的抗性，在盐胁迫下K+含量显著高于拟南芥(p＜0.05)，而Na+含量显著低于拟南芥(p＜0.05)。SA可以进一步促进盐芥吸钾排钠的能力，而PBZ抑制这种能力。
　　(3)盐胁迫拟南芥转录组测序及消减杂交分析
　　通过对盐胁迫前后拟南芥和盐芥的转录组测序和生物信息学分析，利用消减杂交(SSH)技术筛到盐芥中的特异性高表达的基因。对差异表达基因的GO(GeneOntology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway富集分析表明它们主要与激素应答、氧化酶活性、胁迫反应等相关，并且拟南芥和盐芥差异表达的基因所属代谢通路不尽相同，如拟南芥中的差异基因富集在P53、自噬、FoxO等通路上，而盐芥中与盐胁迫相关基因显著富集在NF-kB、HIF-1、MAPK、戊糖磷酸等途径上。当然拟南芥和盐芥差异表达的基因也富集在一些共通的代谢通路上，如氨基酸代谢、糖代谢、以及植物激素信号转导等。
　　另外我们还筛选到一批盐芥特有的差异表达的基因，如C2H2和WRKY转录因子和脱落酸(ABA)信号相关基因。SA通路代表性基因NPR1和PR1在盐胁迫后拟南芥中的表达量降低(Fold change，FC＜1)，而在盐胁迫后盐芥中的表达量却升高(FC＞3)，说明盐芥具有较高的抗盐能力可能与其SA相关基因表达增强或者SA信号激活有关。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 土壤盐渍化的现状

1．2 土壤盐胁迫对植物的危害

1．2．1 Na+／K+失衡对种子萌发率的影响

1．2．2 对植物器官和生长发育的危害

1．2．3 对植物生理生化指标的影响

1．2．4 Na+／K+失衡对作物育性的影响

2 文献综述

2．1 植物抗盐碱能力的获得机制

2．1．1 通过植物适应性驯化

2．1．2 植物育种方法

2．1．3 利用外源物质

2．2 外源SA缓解植物抗Na+／K+失衡机制

2．2．1 促进“吸钾排钠”

2．2．2 SA相关基因表达调控

2．2．3 SA调控其它激素

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．2 实验设计

3．2．1 盐胁迫实验设计

3．2．2 SA和PBZ抗胁迫预处理实验设计

3．2．3 盐胁迫转录组测序实验设计

3．3 生理生化指标检测方法

3．3．1 叶片数目及叶面积检测

3．3．2 植株鲜重和含水量

3．3．3 Na+、K+含量测定

3．3．4 活性氧检测

3．3．5 MDA含量检测

3．3．6 可溶性糖浓度检测

3．3．7 离子渗透率测量

3．4 转录组测序

3．4．1 total RNA提取

3．4．2 RNA浓度和纯度检测

3．4．3 mRNA富集、片段化、建库、上机测序

3．5 转录组数据的生物信息学分析

3．5．1 测序数据的标准分析

3．5．2 差异表达基因分析

3．5．3 差异基因表达模式聚类分析

3．5．4 差异基因的GO分类、富集分析

3．5．5 差异表达基因的KEGG pathway富集分析

3．6 抑制性差减杂交技术(SSH)筛选耐盐胁迫相关基因

3．6．1 RNA提取

3．6．2 cDNA合成

3．6．3 Rsa Ⅰ酶切及纯化

3．6．4 链接接头

3．6．5 SSH

3．6．6 巢式PCR

3．7 差异基因分析

3．7．1 文库阳性克隆的鉴定

3．7．2 差异基因分析

4 实验结果与分析

4．1 盐胁迫对拟南芥生理指标的影响

4．1．1 盐胁迫对叶面积和叶片数的影响

4．1．2 盐胁迫对植株高度的影响

4．1．3 盐胁迫对植株鲜重和含水量的影响

4．1．4 盐胁迫对Na+、K+含量的影响

4．1．5 讨论

4．2 SA和PBZ预处理对缓解拟南芥盐胁迫效果评价

4．2．1 SA和PBZ预处理对含水量和离子渗透率的影响

4．2．2 SA和PBZ预处理对K+和Na+含量的影响

4．2．3 SA和PBZ预处理对活性氧含量的影响

4．2．4 SA和PBZ预处理对MDA和可溶性糖含量的影响

4．2．5 讨论

4．3 转录组测序及SSH技术筛选抗盐胁迫基因

4．3．1 盐胁迫相关差异表达基因筛选

4．3．2 差异基因表达模式聚类分析

4．3．3 差异基因的GO富集分析

4．3．4 差异基因的KEGG pathway富集分析

4．3．5 KEGG pathway的可视化

4．3．6 SSH筛选盐胁迫差异基因

4．3．7 讨论

5 结论

参考文献

致谢

论文发表情况