栽培一粒小麦具有8个半胱氨酸残基的新的y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定

摘要

小麦属及其近缘属种中有很多可利用的优良基因，这些基因不仅可以改变小麦遗传基础还能在提高小麦品质中发挥重要作用。栽培一粒小麦(Triticum monococcum.ssp.monococcum，AmAm，2n=2x=14)是普通小麦的二级基因源，是小麦的重要基础物种。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦重要的储藏蛋白，其组成和数目在小麦加工品质中起着重要的作用。1Ay高分子量谷蛋白亚基在普通小麦中通常是沉默的，但是在四倍体小麦和二倍体小麦中通常是表达的。通过普通小麦与栽培一粒小麦直接杂交转移其可表达的1Ay高分子量谷蛋白亚基比较困难，但是可以通过合成双二倍体并以其为“桥梁”来转移1Ay亚基。本研究通过SDS-PAGE分析、目的基因克隆、原核表达等方法对栽培一粒小麦PI560726可表达的1Ay亚基及其在合成的双二倍体中的表达进行了研究，主要结果如下:
　　1.SDS-PAGE分析结果表明，栽培一粒小麦PI560726的y-型高分子量谷蛋白亚基的电泳迁移率比普通小麦地方品种“中国春”的1By8亚基稍快，在此位置的y-型高分子量谷蛋白亚基未见报道，依据电泳迁移率的大小将该y-型高分子量谷蛋白亚基命名为1Ay8.2。
　　2.栽培一粒小麦PI560726的y-型高分子量谷蛋白亚基1Ay8.2的编码基因(GenBank No.KP137569)与以前报道的可表达1Ay亚基相比，该亚基在其氨基酸序列N-端103位置处有一个额外的半胱氨酸残基，而且它还拥有只存在于少部分1Ay高分子量谷蛋白亚基中央重复区的1个半胱氨酸残基，使其半胱氨酸残基数目达到了8个。
　　3.利用1Ay8.2基因的编码区序列设计了一对表达引物对其基因进行体外表达。1Ay8.2亚基体外表达所得产物在SDS-PAGE上的条带位置与的栽培一粒小麦PI560726种子蛋白的1Ay8.2亚基迁移率一致，并且对照中无相应产物。
　　4.进化分析表明，除了来源于野生一粒小麦的EU984508之外的所有Glu-A1-2编码高分子量谷蛋白亚基都聚在了一个分支中。1Ay8.2亚基与含有7个半胱氨酸的EU984506和JQ318695聚在了Glu-Al-2位点分支中的一个亚分支中。
　　5.利用四倍体小麦做母本，栽培一粒小麦PI560726为父本杂交获得杂种F1，然后通过0.1％的秋水仙碱溶液加倍，成功创制了双二倍体Z1609。SDS-PAGE分析表明，1Ay8.2亚基在双二倍体Z1609里得到了表达。从双二倍体Z1609获得的1Ay8.2亚基的编码基因通过大肠杆菌体外表达得到了验证。期望利用1Ay8.2亚基替换普通小麦中沉默的1Ay亚基，从而增加普通小麦高分子量谷蛋白亚基的数目并通过额外的半胱氨酸残基促进二硫键的共价相互作用来提高小麦品质。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 小麦HMW-GS相关研究及其进展

1．1．1 HMW-GS与小麦加工品质

1．1．2 HMW-GS的结构特征

1．2 小麦HMW-GS 1Ay亚基的研究进展

1．3 栽培一粒小麦育种相关性状研究

1．4 四倍体小麦-一粒小麦双二倍体研究现状

1．5 立题依据

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 SDS-PAGE分析

2．2．2 基因组DNA提取

2．2．3 基因组DNA的PCR扩增

2．2．4 PCR产物T-载体克隆

2．2．5 热击感受态的制备

2．2．6 转化大肠杆菌

2．2．7 阳性克隆筛选

2．2．8 DNA序列测定与分析

2．2．9 1Ay基因的体外表达

2．2．10 双二倍体的创制

3 结果与分析

3．1 SDS-PAGE分析

3．2 1Ay8．2亚基的分子克隆

3．3 1Ay8．2亚基与其他可表达的1Ay亚基的比较

3．4 1Ay8．2亚基的体外表达

3．5 HMW-GS氨基酸序列的聚类分析

3．6 1Ay8．2亚基在双二倍体中的表达和分析

4 讨论

4．1 1Ay8．2亚基及其对小麦品质改良的潜在影响

4．2 含有1Ay8．2亚基的双二倍体的潜在利用价值

参考文献

致谢

硕士期间发表的文章