贡嘎蝙蝠蛾粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)遗传多样性的SCoT和ISSR标记研究

摘要

贡嘎蝙蝠蛾（Hepialus gonggaensis）是形成冬虫夏草的虫体之一，在其繁育过程中易被粉拟青霉（Paecilomyces farinosus）侵染而罹患拟青霉病。为研究病原菌的遗传多样性，分别采用L12(41×33)混合水平正交实验设计优化SCoT-PCR和ISSR-PCR的反应体系并筛选出最佳反应循环次数、引物及相应退火温度，在此基础上利用SCoT和ISSR两种分子标记方法研究了80株粉拟青霉的基因组DNA并进行聚类分析和两种标记方法的比较。试验结果如下：
　　1.粉拟青霉菌遗传多样性的SCoT分析
　　优化后的粉拟青霉SCoT-PCR反应体系为:20μL体系中，DNA45ng、引物0.7μmol/L、MIX混合液7μL、Taq酶1U，反应体系的最适循环次数为40次。应用此反应体系从15个SCoT通用引物中选出条带多态性高且清晰的10条引物，分别是S12、S13、S14、S15、S19、S28、S29、S31、S32、S34。分别以80株粉拟青霉DNA为模板，采用上述PCR反应条件进行SCoT-PCR。10条SCoT引物共获得104个扩增位点，其中多态性位点69个，多态性比率为66.35％。对SCoT-PCR的结果进行聚类分析得出:80株粉拟青霉菌种内有着丰富的遗传多态性，遗传相似系数在0.66-0.95之间，且在0.751处可分为六大类。
　　2.粉拟青霉菌遗传多样性的ISSR分析
　　优化后的ISSR-PCR反应体系为:20μL体系中，DNA60ng、引物0.6μmol/L、MIX混合液6曲、Taq酶0.8U，反应体系的最适循环次数为40次。应用此反应体系从15个ISSR通用引物中选出条带清晰且多态性高的10条引物，分别是701、702、703、807、808、809、810、835、855、873。分别以80株粉拟青霉DNA为模板，采用上述PCR反应条件进行ISSR-PCR。10条ISSR引物共获得96个扩增位点，其中多态性位点56个，多态性百分率为58.33％。对ISSR-PCR结果进行聚类分析得出:80株菌的遗传相似系数在0.70-0.96之间，在0.756处可分为五大类。
　　3.粉拟青霉遗传多样性的SCoT和ISSR比较分析
　　SCoT扩增的平均条带数、多态性位点数和多态性百分率均略高于ISSR标记，说明SCoT标记能检测出更多的多态性遗传位点，略优于ISSR分子标记。ISSR标记的遗传相似系数的范围及其平均值，以及将供试菌株分类处的遗传相似系数均大于SCoT标记，说明SCoT标记方法比ISSR标记方法具有更高的辨识度。
　　根据SCoT和ISSR两种标记方法得出来的两个聚类结果可以得出以下结论:分离自楼房外南面木头的65号菌单独分成一大类是因其遗传距离最远;同一地方地理来源的菌株没有全部分到同一类群中，正如分离自楼房南面外墙的12号和26号菌以及分离自楼房北面外墙的20和61号菌分别被分到不同的两大类群中;分离自二楼实验室8、9、10、11、14号房以及中央大厅的菌株都被分在不同类群中。来源于同一虫体或虫态的菌株大部分是分在不同类群中，但也有少数菌株分在同一类。例如分离自贡嘎蛹上的16号和46号菌分别被分到不同的两大类群中，以及分离自3-4龄贡嘎幼虫身上的37和62号菌分别被分到不同的两大类群中。分离自5-6龄贡嘎幼虫身上的48号和78号菌都归属于同一类群;分离自西藏林芝幼虫身上的1号菌、6-8龄贡嘎幼虫身上的14号菌和贡嘎蛹上的16号菌都分在了第Ⅰ(1)亚类中。
　　试验结果中分离自人工繁育基地不同环境或虫态的蝙蝠蛾粉拟青霉与采集分离自地理远缘的西藏林芝、青海拉脊雪山、甘肃玛曲、四川小金不同虫态蝙蝠蛾的粉拟青霉可以聚在相同或不同类群中，充分明了四川康定折多山冬虫夏草人工繁育基地的粉拟青霉具有丰富的遗传多样性。

目录

声明

论文说明

摘要

1 文献综述

1．1 贡嘎蝙蝠蛾粉拟青霉病概述

1．1．1 贡嘎蝙蝠蛾粉拟青霉病现状

1．1．2 粉拟青霉的主要特征及分类地位

1．1．3 粉拟青霉的生物学特性

1．2 遗传多样性在病原菌中的研究进展及意义

1．2．1 形态学研究方法

1．2．2 细胞学标记法

1．2．3 生化遗传标记法

1．2．4 分子标记法

1．2．5 遗传多样性在病原菌中的研究意义

1．3 SCoT标记技术及应用

1．3．1 SCoT技术在鉴定与检测中的应用

1．3．2 SCoT技术在真菌遗传多样性研究中的应用

1．3．3 SCoT在遗传分化研究中的应用

1．4 ISSR标记技术及应用

1．4．1 ISSR技术在鉴定与检测中的应用

1．4．2 ISSR技术在真菌遗传多样性研究中的应用

1．4．3 ISSR在遗传分化研究中的应用

1．5 不同分子标记在同一种质资源遗传多样性中的应用

1．6 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 供试试剂

2．1．3 供试引物

2．1．4 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 菌丝体的培养与收集

2．2．2 DNA的提取方法

2．2．3 DNA浓度与纯度检测

2．3 ITS方法鉴定

2．3．1 ITS-PCR体系及程序

2．3．2 ITS-PCR产物检测

2．4 SCoT方法

2．4．1 SCoT-PCR体系建立及优化

2．4．2 SCoT引物筛选

2．4．3 SCoT-PCR反应及产物检测

2．4．4 数据处理及分析

2．5 ISSR方法

2．5．1 ISSR-PCR体系建立及优化

2．5．2 ISSR引物及退火温度筛选

2．5．3 ISSR-PCR反应产物检测

2．5．4 数据处理方法

3 结果与分析

3．1 DNA的检测

3．2 rDNA-ITS区电泳图结果

3．3 SCoT标记分析

3．3．1 SCoT-PCR体系建立及优化

3．3．2 SCoT引物筛选

3．3．3 SCoT-PCR扩增及分析

3．4 ISSR标记分析

3．4．1 ISSR-PCR体系建立及优化

3．4．2 ISSR引物筛选

3．4．3 ISSR-PCR扩增及分析

3．5 SCoT与ISSR的比较分析

3．5．1 SCoT和ISSR的DNA扩增结果多态性的比较分析

3．5．2 SCoT和ISSR聚类结果的比较分析

4 结论与讨论

致谢

参考文献