猪FTO原核表达及其对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

摘要

脂肪量和肥胖相关基因(fat mass and obesity-related gene，FTO)是近几年发现的能影响机体脂肪沉积的新基因，其单核苷酸多态性位点与猪肉质性状指标呈显著正相关，揭示该基因可能是影响猪肌内脂肪沉积的候选基因。为探究该基因对肌内脂肪沉积的影响，本研究通过原核表达得到猪FTO重组蛋白，并制备其多克隆抗体以探讨猪FTO组织表达规律及其在细胞中的定位，同时以猪肌内前体脂肪细胞为研究对象，探讨FTO基因对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响，主要研究内容及结果如下：
　　1、猪FTO基因的原核表达
　　以提取的猪背最长肌总RNA反转录的cDNA为模板克隆出猪FTO基因，将其插入到原核表达载体pET30a(+)中，获得的重组质粒命名为pET30a(+)-pFTO。将重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，同时优化其诱导表达条件，通过SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，随后用Ni2+-IDA亲和层析柱纯化后进行western blot鉴定。结果表明，重组蛋白在30℃经0.75mmol/L IPTG诱导4h达最佳表达，表达蛋白分子量约56 kDa。纯化的重组蛋白能被抗组氨酸标签单克隆抗体特异性识别，揭示本试验成功获得了高纯度的FTO重组蛋白。
　　2、猪FTO组织表达规律及亚细胞定位研究
　　以纯化的FTO重组蛋白多次免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。多克隆抗体的效价和特异性分别用间接ELISA和western blot鉴定;进一步用制备的FTO多克隆抗体检测FTO蛋白在10周龄DLY猪背最长肌、趾长伸肌、比目鱼肌、腰大肌、腹部脂肪、肝脏、肺、肾脏和心脏等组织中的表达情况;另外，用酶解法从3日龄DLY猪背最长肌中分离肌内前体脂肪细胞，采用实时荧光定量PCR检测成脂相关基因如脂联素、PPARγ和C/EBPα的表达变化，同时用油红O染色检测脂滴生成情况。并进一步采用免疫荧光分析FTO在猪肌内前体脂肪细胞中的定位。结果表明，制备的FTO多克隆抗体滴度达1∶40960，且该多克隆抗体能够特异性识别FTO重组蛋白。FTO蛋白主要表达于脂肪和肺脏组织，肝脏和肌肉中有少量的表达。另外，本试验分离出的猪肌内前体脂肪细胞能高表达成脂相关基因并能分化为成熟的脂肪细胞，且FTO主要定位于细胞核。揭示本实验成功制备了猪FTO多克隆抗体及分离了猪肌内前体脂肪细胞。FTO主要定位于细胞核，且其与脂肪沉积有关。
　　3、FTO对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响
　　通过过表达或siRNA干扰处理猪肌内前体脂肪细胞，采用EdU增殖分析和western blot检测phospho-Histone H3蛋白表达探讨FTO对猪肌内前体脂肪细胞增殖的影响。同时在猪肌内前体脂肪细胞中过表达FTO或siRNA干扰FTO，诱导分化8d后进行油红O和甘油三酯检测脂滴生成情况，并采用实时荧光定量PCR和western blot检测脂肪细胞分化相关基因和蛋白的表达。结果表明，过表达FTO能显著提高EdU阳性细胞增殖率并显著上调phospho-HistoneH3蛋白表达，而siRNA干扰FTO得到相反的结果。另外，过表达FTO能促进脂滴生成，同时能显著上调PPARγ、C/EBPα和LPL等脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达以及PPARγ和C/EBPα的蛋白表达，且siRNA干扰FTO得到相反的结果。以上结果表明FTO能显著促进猪肌内前体脂肪细胞的增殖和分化。
　　综上所述，本研究通过原核表达获得了高纯度的猪FTO重组蛋白并制备了其多克隆抗体;FTO蛋白主要表达于脂肪组织，肝脏和肌肉中也有少量表达，且FTO主要定位于细胞核;细胞试验证明FTO能显著促进猪肌内前体脂肪细胞的增殖和分化。这些结果揭示FTO可能是影响猪肌内脂肪沉积的候选基因。

目录

论文说明

声明

摘要

主要缩略词

前言

第一章 文献综述

1 肌内前体脂肪细胞体外培养及其增殖分化概况

1．1 肌内脂肪与肉质

1．2 肌内前体脂肪细胞体外培养

1．3 脂肪细胞的增殖和分化

2 FTO基因研究现状

2．1 FTO基因的发现

2．2 FTO的结构及定位

2．3 FTO的分布及表达

2．4 FTO与肌内脂肪沉积相关性

2．5 FTO与脂肪沉积

第二章 本研究的目的、意义、内容和技术路线

第三章 试验研究

试验一 猪FTO基因的原核表达

1 引言

2 试验材料

3 试验方法

4 试验结果与分析

5 讨论

6 小结

试验二 猪FTO组织表达规律及亚细胞定位研究

1 引言

2 试验材料

3 试验方法

4 试验结果及分析

5 讨论

6 小结

试验三 猪FTO对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

1 引言

2 试验材料

3 试验方法

4 试验结果

5 讨论

6 小结

第四章 全文总结

1 本研究主要结论

2 本研究主要创新点

3 有待于进一步研究的问题

参考文献

致谢

个人简历