梅山猪不同泌乳期乳汁exosome中miRNA表达谱差异研究

摘要

miRNAs是一类广泛存在真核细胞中的内源性非编码RNA，miRNA序列在物种间高度保守，在表达上具有时空特异性，miRNA通过种子序列与靶基因作用在转录后水平调控基因表达。miRNA参与多种生物学进程，包括细胞增殖分化、个体发育、细胞凋亡衰老、机体免疫等。大多数活细胞都能够分泌exosome，它是一种直径约100nm的纳米囊泡，近年来研究发现exosome能够作为细胞间信号介导因子传递内容物（核酸、蛋白质、脂质等）从而在细胞交流中发挥重要作用。母乳是人类和其他哺乳动物婴儿最理想的天然食品，它在婴儿的全身性抗病和局部防病上发挥重要作用，能促进婴儿免疫系统迅速成熟，帮助婴儿抵抗细菌和病毒侵袭，提高其自身抵抗疾病的能力。猪是研究人类疾病的理想模型，目前，在母乳提高免疫能力、增强对疾病抵抗能力的分子机理的研究还不够系统，且主要集中关注DNA和mRNA水平的蛋白编码基因。本研究采集梅山猪6个泌乳时期（出生后0、3、7、14、21和28d）的乳汁样品，利用ExoQuick试剂盒分离乳汁中exosome，并通过AMF进行鉴定，通过small RNA-seq技术鉴定不同泌乳阶段猪乳汁exosome中miRNA表达谱差异，并检测猪乳汁exosome中miRNA的稳定性，以期为研究母乳对婴儿的调控功能提供基础资料。主要结果如下:
　　(1)梅山猪母乳中脂肪和乳糖含量随泌乳期的延长而增加，而蛋白含量随泌乳期的延长而降低，尤其是免疫相关蛋白。
　　(2)梅山猪乳汁中含有丰富的exosome，呈扁平圆环状结构，并且与外种猪（约克夏）exosome的形态和大小高度相似。
　　(3)猪乳汁exosome中存在有大量长度小于300nt的small RNAs，尤其是在长度100nt左右出现了两个明显的峰值，表明在猪乳汁exosomes中确实存在small RNA的富集现象。
　　(4)通过对不同泌乳期乳汁exosome进行small RNA-seq，本研究共鉴定到440个miRNA，其中287个已知miRNA，新发现153个miRNA。
　　(5)猪乳汁exosome中miRNA的表达谱呈现典型的泌乳特异性模式，初乳（出生后0d和3d）和常乳（出生后7～28d）间存在显著差异。定量分析表明，13种在6个泌乳阶段的miRNA文库里表达量最高的免疫相关的特异性高丰度miRNAs中，除miR-148a-3p外，几乎所有其它12种特异性miRNAs在泌乳早期阶段（出生后0d和3d)的表达量都高于泌乳晚期（出生后7、14、21和28d）。这些免疫相关的miRNAs都会功能性地靶向编码细胞活素和其它免疫调节蛋白，以及免疫反应信号通路上的其它组分等特异性转录本而承担免疫调控功能。
　　(6)与外源添加的线虫特异性miRNAs相比，内源性猪乳汁exosome来源的miRNAs对不同的极端理化条件（低温、高温、低pH、反复冻融、外源RNA酶等）表现出较强的抗降解能力和较高的稳定性，说明猪乳汁exosome中的miRNAs非常稳定，可以保护其在不同极端条件下免受内源性RNA酶的降解作用。
　　综上所述，本研究发现梅山猪乳汁中脂肪和乳糖含量随泌乳期的延长而增加，而蛋白含量随泌乳期的延长而降低;不同泌乳期乳汁中富含exosome，这些exosome中负载了高丰度的small RNA，猪乳汁exosome中miRNA呈现典型的泌乳期特异性表达模式，且初乳与常乳中存在显著差异;另外，exosome源的miRNA具有较高的稳定性，能够抵抗极端理化条件，本研究显示乳汁exosome中miRNA潜在的生物学功能。

目录

论文说明

声明

摘要

1文献综述

1．1细胞外小泡体(EVs)与Exosome

1．1．1 EVs的发现史

1．1．2 EVs的定义

1．1．3 EVs的生物学分布

1．2人类体液中的EVs

1．2．1体液中EVs的功能

1．2．2尿液中的EVs

1．2．3唾液中的EVs

1．2．4母乳中的EVs

1．2．5血液中的EVs

1．3 EVs的分离及鉴别

1．4细胞源EVs的分类及其特性

1．5 EVs的吸收机制

1．6 EVs在免疫系统中的作用

1．6．1先天免疫

1．6．2获得性免疫

1．7 EVs与’核酸

1．7．1 RNA

1．7．2 DNA

2本研究的目的及意义

3材料与方法

3．1实验猪只和乳汁收集

3．1．1实验猪只的选择

3．1．2乳汁采样时间的确定

3．1．3乳汁的收集

3．2乳汁exosome的AFM检测

3．2．1乳汁exosome的制备

3．3乳汁exosome中RNA的抽提和分析

3．3．1乳汁exosome中RNA的抽提

3．3．2乳汁exosome中RNA的质量分析

3．4 Small RNA测序及其功能与表达谱分析

3．4．1乳汁样品的分组和small RNA文库的构建

3．4．2 Small RNA测序

3．4．3测序数据处理

3．4．4 miRNA的预测和挖掘

3．4．5 miRNA的表达特性和表达谱分析

3．5各泌乳阶段特异性高丰度miRNAs表达水平的q-PCR定量检测

3．5．1 q-PCR的检测方法

3．5．2 miRNA的表达水平分析

3．5．3高丰度miRNAs在不同泌乳期乳汁中的表达量差异分析

3．6猪乳汁exosome中miRNAs的稳定性分析

3．6．1极端环境条件处理

3．6．2 miRNA表达水平的q-PCR定量检测

3．6．3统计分析和显著性检验

4结果与分析

4．1乳汁及exosome的主要表型性状指标及表征参数

4．2猪乳汁中exosome的分离和检测

4．2．1乳汁exosome的制备

4．2．2乳汁exosome的AFM检测

4．3猪乳汁exosome中RNA的抽提和分析

4．3．1猪乳汁exosome中RNA的抽提

4．3．2猪乳汁exosome中的RNA分析

4．3．3乳汁exosome的形态测定

4．3．4猪乳汁exosome中miRNAs的分析鉴定

4．4免疫相关miRNA在初乳和常乳间的表达差异

4．5乳汁Exosome来源miRNAs的抗降解能力和稳定性分析

5讨论

5．1关于乳汁Exosome

5．2关于miRNA和乳汁Exosome miRNAs

5．3猪具有作为理想动物模型的优势

6结论

6．1猪乳汁中含有丰富的Exosome

6．3猪乳汁exosome中免疫相关的高丰度miRNAs存在较强的抗降解能力和稳定性

参考文献

致谢