四川省部分地区副猪嗜血杆菌的血清型调查及间接ELISA方法的构建

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）作为一种猪呼吸道的条件致病菌，能引起猪的肺炎、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、脑膜炎和关节炎以及胸腔积液、心包积液、腹腔积液和关节积液，严重阻碍猪的生长育肥，并可致死亡，是保育猪威胁最大的病原菌之一。本研究从四川省部分地区的猪场采集疑似Hps感染病料进行Hps的分离、鉴定与分型，同时表达、纯化了Hps的YfeA蛋白，构建用于检测Hps抗体的间接ELISA方法。
　　1.四川省部分地区Hps血清型调查
　　2014年至2016年间，在四川省部分地区的规模化猪场及养猪合作社共采集649份病料，分离到288株Hps野毒，总分离率为44.38％，各年度分离率无显著差异。四川东部和西部地区发病情况基本一致，3～8周龄的猪分离率显著高于哺乳仔猪和8周龄以上的猪，冬、春季节分离率显著高于夏、秋季节。
　　结合多重PCR和琼扩试验，对四川省部分地区Hps的血清型分布做了研究，结果表明，7.29％的分离株无法分型。2014年～2016年，四川省部分地区以血清4型、5型最为流行，其次为血清7型，未能分离到血清3型、6型、10型和15型的菌株。
　　2.Hps抗体检测间接ELISA构建
　　通过构建重组质粒pET-28a-yfeA，经转化、诱导、超声破碎、纯化，得到大小为36kDa、浓度为0.698mg/mL的Hps YfeA蛋白。经方阵滴定实验，最终确定YfeA蛋白最佳包被浓度为0.25μg/孔，HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度为1∶4000，待检血清的最佳稀释度为1∶40，封闭、稀释和显色条件也做了相应优化。经计算，试验的判定前提为:阳性对照-阴性对照＞0.6，判定标准为:（样品OD450nm-空白对照）/（阳性对照-空白对照）≥0.4，判为阳性，反之判为阴性。经比较，该方法优于全菌抗原间接ELISA，并具有良好的批内和批间重复性，与进口商品化试剂盒的阳性和阴性符合率分别为79.2％和75％。