猕猴NAFLD组织病理学诊断及YAP介导的该病发病机制研究

摘要

近年来非酒精性脂肪肝病(NAFLD)对人类健康的危害不断增加，是当代医学领域的研究热点和挑战。本研究旨在探讨YAP(Yes associated protein)与TGF-β(Transforming growth factor-β)/Smad信号通路及其相互作用对NAFLD发生发展的调控机制，对NAFLD治疗靶点的发现具有重要的作用。
　　猕猴高脂饲料饲喂两年，肝活检取材两条组织，分别4％多聚甲醛固定和液氮冰冻，采血做血液生化检测。HE、Masson、油红O染色筛查简单脂肪变性、NASH(Non-alcoholic steatohepatitis)、肝纤维化猕猴;免疫组织化学、实时荧光定量PCR分别检测目的蛋白表达位置及表达水平和mRNA相对表达量;大鼠肝细胞培养(5％CO2，10％FBS培养基)，MTT法做Verteporfin对细胞的毒性试验;实时荧光定量PCR检测细胞各目的基因的相对表达量;蛋白质印迹检测细胞目的蛋白质表达量。
　　1.猕猴肝活检病理结果显示:猕猴肝脏正常的有23只，参考Elizabeth M.Brunt(1999，2005)评分标准，NASH评分1～3分的猕猴有45只，大于4分的猕猴9只，肝纤维增生1期的猕猴19只，2-3期的猕猴5只。对筛选后猕猴血液生化统计结果显示，与正常和患有简单脂肪肝的猕猴相比，患有NASH的猕猴的FPG和TG显著升高(P＜0.01)，其他未见异常。
　　2.NASH猕猴肝脏研究结果显示:NASH猕猴肝脏中YAP、TGF-β、Smad3、CTGF和α-SMA的蛋白表达量均显著高于简单脂肪变性猕猴（P＜0.01），简单脂肪变性猕猴肝脏中YAP，TGF-β，Smad3，CTGF和α-SMA的蛋白表达量均显著高于正常猕猴(P＜0.01);NASH猕猴肝脏中Smad7的蛋白表达量显著低于简单脂肪变性猕猴（P＜0.01），简单脂肪变性猕猴显著低于正常猕猴(P＜0.01)。YAP、TGF-β、Smad3和Smad7在NASH猕猴肝脏中mRNA表达量极显著高于简单脂肪变性猕猴（P＜0.01），而在简单脂肪变性猕猴组和正常猕猴肝脏中表达量差异无统计学意义(P＞0.05);CTGFmRNA表达量随着疾病的严重程度而增加，并且差异均极显著(P＜0.01)。与正常猕猴和简单肝脂肪变性猕猴相比，NASH猕猴肝脏中α-SMA mRNA表达量极显著增加(P＜0.01)。
　　3.肝纤维化研究结果显示:肝纤维化猕猴肝脏中YAP、TGF-β、Smad3、CTGF和α-SMA的蛋白表达量随着肝纤维化程度的增加而增加，YAP、TGF-β和α-SMA、CTGF蛋白表达量各组之间差异显著（P＜0.05或P＜0.01）;Smad3的蛋白表达量在纤维化1a期和纤维化1c期增多的差异不显著(P＞0.05);与对照组相比，猕猴肝纤维化期Smad7的蛋白表达量显著下降(P＜0.05)，纤维化1c期Smad7的蛋白表达量极显著高于纤维化2-3期(P＜0.01)，而纤维化1a期和纤维化2-3期间的Smad7的表达量差异不显著（P＞0.05）。YAP、α-SMA、TGF-β、CTGF mRNA表达量随着纤维化程度的增加而增加，各组间差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，CTGF mRNA表达量正常猕猴组与纤维化1a期差异不显著(P＞0.05);纤维化1c期Smad3mRNA的表达量显著低于纤维化1a、2-3期和正常猕猴(P＜0.05或P＜0.01)，其它组差异不显著(P＞0.05);纤维化1a期的Smad7mRNA表达量极显著高于其他三组(P＜0.01)，正常猕猴组与纤维化2-3期的表达量无差异(P＞0.05)，纤维化1c期表达量极显著低于正常猕猴组与纤维化2-3期(P＜0.01)。
　　4.细胞试验结果显示:MTT试验法发现在Verteporfin浓度为250nmol/L时，大鼠肝细胞的存活率最高，并且极显著高于其他浓度的存活率。蛋白质印迹检测结果显示，与没有Verteporfin处理的肝细胞相比，处理后Smad7的蛋白含量极显著上升（P＜0.01）;加Verteporfin处理后Smad3和YAP的蛋白含量极显著减少(P＜0.01)。大鼠肝细胞荧光定量PCR结果显示，TGF-β刺激大鼠肝细胞0h、1h、2h和8h时，Verteporfin处理组与没有Verteporfin处理组相比，YAP、Smad3mRNA表达量显著降低(P＜0.01或P＜0.05)，0.5h和4h时，YAP mRNA表达量差异不显著(P＞0.05），4h时Verteporfin处理组Smad3RNA表达量显著降低（P＜0.05），0.5h时差异不显著(P＞0.05);Smad7RNA表达量在0h、1h、0.5h、2h、4h、8h时Verteporfin处理组显著高于没有Verteporfin处理组(P＜0.05或P＜0.01)。
　　在猕猴NAFLD中，YAP和TGF-β信号通路的关键因子参与了其发生发展的重要调控。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分文献综述

1非酒精性脂肪性肝病

2 NAFLD病因

3 NAFLD发病机制

4 NAFLD的诊断

5 NAFLD的治疗

6 NAFLD的动物模型

6．1 Ob／ob小鼠模型

6．2 Db／db小鼠模型

6．3 PTEN基因敲除小鼠模型

6．4美式生活诱发的肥胖综合症模型

6．5高胆固醇饮食诱发的肥胖综合症模型

6．6甲硫氨酸胆碱缺乏饮食诱发的NAFLD模型

6．7胆碱缺乏型L-氨基酸限定饮食

7 TGF-β信号通路与NAFLD

8 Hippo信号通路与NAFLD

9选题意义

第二部分正文

1．3耗材与试剂

1．4部分溶液配制

2实验方法

2．1血液生化评估

2．2样品采集

2．3 NAFLD猕猴病理诊断

2．4 YAP介导的NAFLD致病机制研究

3试验结果

3．1 NAFLD猕猴病理学诊断

3．2 YAP介导的NAFLD致病机制研究

4讨论

4．1 NASH猕猴筛选评分标准

4．2 TGF-β／Smads信号通路对NAFLD的调控

4．3 YAP对NAFLD的调控

4．4 YAP和TGF-β／Smads信号通路相互作用对NAFLD的调控

5结论与创新点

5．1结论

5．2创新点

参考文献

致谢

作者简历