热应激对小鼠C2C12成肌细胞硒蛋白表达的影响及硒源缓解热应激的机制研究

摘要

本研究拟以小鼠肌肉C2C12细胞系为研究材料，构建骨骼肌细胞热应激模型，通过两个试验:1）考察热应激对小鼠肌肉C2C12细胞分化的影响，并考察在此过程中硒蛋白表达的变化;2）比较两种不同硒源对小鼠肌肉C2C12热应激的缓解效应并探索其可能机制。主要内容及结果如下:
　　实验一:热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化及硒蛋白表达的影响。
　　选择小鼠C2C12成肌细胞作为试验材料，构建肌肉细胞热应激模型，考察热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响，同时考察硒蛋白表达的变化。采用单因子试验设计:C2C12细胞首先于37℃二氧化碳培养箱中培养2～3d至铺板率达到80％;然后分成2组进行成肌分化诱导:对照组于37.0℃培养4、6、8d;热应激组于41.5℃培养4、6、8d，采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达，采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及5个硒蛋白的表达。
　　研究结果表明:(1)热应激抑制了C2C12细胞分化和损伤了肌肉肌管的发育，下调了(P＜0.05)C2C12细胞MYOD、MYOGENIN基因和MYOGENIN蛋白的表达，同时上调(P＜0.05)HSP70、BCL-2/BAX基因和蛋白表达;(2)热应激4、6和8d后分别上调了(P＜0.05)C2C12细胞中18、11和8个硒蛋白基因，热应激6和8d后仅下调（P＜0.05）了DIO2基因表达;(3)热应激6d上调了(P＜0.05)C2C12细胞GPX1、GPX4和SELENON蛋白的表达，下调了(P＜0.05)SELENOS蛋白的表达。热应激对骨骼肌细胞成肌分化造成损伤的同时伴随着大量的硒蛋白基因和蛋白的上调表达，这预示着硒蛋白在热应激条件下可能对分化的骨骼肌细胞起着某种保护作用。
　　试验二:不同硒源对小鼠C2C12成肌细胞热应激的缓解效应及机制研究
　　考察不同硒源（硒代蛋氨酸SeMet和亚硒酸钠SS）的添加对分化的小鼠C2C12成肌细胞热应激缓解作用及细胞中硒蛋白表达的影响。C2C12细胞在37℃完全培养液中培养至80％融合时，换2％马血清诱导培养基进行分化诱导，细胞四个处理组:CK组在37℃培养;HS组:在41.5℃培养;HS+SS组:添加终浓度为0.50μmolSe/L的SS后，在41.5℃培养;HS+SeMet组:添加终浓度为0.50μmol Se/L的SeMet后，在41.5℃细胞。处理4、6、8天后收集样品，采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达，采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及3个硒蛋白的表达。
　　研究结果表明:(1)热应激抑制C2C12成肌细胞分化，并伴随着MYOD和MYOGENIN基因，以及MYOGENIN蛋白表达的降低，同时上调了HSP70基因和蛋白的表达;(2)热应激4、6和8d分别上调(P＜0.05)14、10和14个硒蛋白基因的表达，分别下调(P＜0.05)1、4和3个硒蛋白基因的表达;(3)与HS组相比，添加SS和SeMet后在不同的时间段均不同程度恢复上调了AMPK、MYOGENIN和MYOD基因以及MYOGENIN蛋白的表达，降低了HSP70基因和蛋白表达、总体而言SeMet组缓解效果优于SS组;(4)与HS组相比，添加SS和SeMet后不同程度恢复上述变化的硒蛋白的表达，硒蛋白基因的表达丰度更接近CK组，总体而言SeMet组与SS组相比硒蛋白基因表达模式更接近CK组;(5)添加SS和SeMet均显著上调（P＜0.05）了热应激4d对蛋白SELENON表达，而添加SeMet在热应激6d时SELENON蛋白表达接近正常组。
　　综上所述，热应激抑制了小鼠C2C12成肌细胞分化，降低了小鼠肌肉C2C12细胞分化相关基因和蛋白表达，上调了HSP70基因和蛋白表达，与此同时众多硒蛋白基因的表达受到影响，预示这些硒蛋白与细胞热应激的调控之间存在密切的关系;添加SS和SeMet后均可在一定程度上缓解热应激对HSP70和分化相关基因(MYOD和MYOGENIN)和蛋白的影响;SS和SeMet可能是通过调控硒蛋白基因的表达进而发挥缓解细胞热应激的作用。总体而言，在小鼠成肌细胞中有机硒(SeMet)对热应激的缓解作用优于无机硒(SS)。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩写词表

前言

第一章文献综述

1热应激

1．1热应激对畜牧业的影响

1．2C2C12细胞的分化过程以及热应激的影响

2硒

2．1微量元素硒

2．2硒的分布和种类

2．3硒对畜禽热应激的缓解作用

3硒蛋白

3．1硒蛋白简介及功能

3．2硒蛋白与肌肉

3．3影响硒蛋白表达因素

第二章有待研究的问题及本研究的目的与意义

3试验技术路线

第三章试验研究

试验一热应激对C2C12细胞成肌分化及硒蛋白表达的影响

2材料方法

3数据处理和统计分析

4实验结果与分析

5讨论

6小结

试验二：硒源小鼠C2C12细胞热应激的缓解效应及机制研究

2材料与方法

3数据处理和统计分析

4试验结果与分析

5讨论

6小结

第四章全文总结

1全文结论

2本研究的创新点

3研究不足及展望

参考文献

致谢