RNA干扰技术用于哺乳动物细胞中报告基因、端粒酶相关基因的表达抑制研究

摘要

本研究选用半衰期仅1h的非稳定型载体pd1EGFP、表Luciferase的pGL3-control及表达红色荧光蛋白的pdsRed2为靶载体，构建了一系列pAVU6+27-shRNA表达载体。通过设计一系列RNAi实验控制，将上述载体共转染于哺乳动物细胞中，运用RT-PCR及Westernblot半定量检测mRNA及蛋白的表达，以确定其干扰效率。本研究结果表明：①pAVU6+27是一种高效的shRNA表达载体，其U6启动子转录小发夹RNA介导的RNAi可以显著降低体外增殖的哺乳动物细胞中相应序列基因的表达，而且这种抑制作用呈现高效性、特异性特征；②RNAi具有明显的“靶点效应”，即基因编码区不同位置的siRNA序列可以介导不同抑制效应的RNAi，提示RNAi效率的大小不仅取决于RNA与靶mRNA结合的能力，还与结合的靶序列本身有关；③共转染实验结果表明不同shRNA表达载体两两间没有相互增强或减弱的RNAi干扰效应。提示在体外哺乳动物细胞中，基于载体表达的RNAi呈现一定的“阈值”效应；④体外增殖的哺乳动物细胞中，shRNA表达载体的转染能显著抑制瞬时或稳定表达的外源报告基因、内源性基因的表达。其RNAi效应在一定时间范围内呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势，表现为明显的时间依赖性效应；⑤在一定剂量范围内，shRNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关，当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时，抑制效应则维持在一“平台期”，表现为一定范围内的剂量依赖性效应；⑥Dicer酶基因是shRNA介导的RNAi通路的关键成分，Dicer基因本身的表达受抑不能介导正常的RNAi通路；⑦有效的实验控制对RNAi研究十分必要。这些实验控制可定量地估计RNAi的作用效率大小，在RNAi特异性验证、鉴别RNAi与microRNA途径上也起到了重要的作用。

目录

声明

第一部分：短发夹RNA介导RNA干扰的时间剂量效应及实验控制研究

前言

材料和方法

结 果

1shRNA阳性克隆载体的鉴定

2shRNA阳性克隆载体测序验证

3转染条件的优化及转染效率测定

4脂质体转染的细胞活力测定

5shRNA的瞬时表达对外源报告基因的干扰效应

6针对EGFP基因三个靶位点的干涉质粒介导的RNAi效应

7仅单链构造、碱基错配shRNA载体介导的RNAi效应

8psh-diEGFP介导时间依赖性RNAi效应

9psh-diEGFP介导的剂量依赖性的RNAi效应

10psh-diEGFP介导的时间和剂量依赖性的RNAi效应

11EGFP-HEK293H稳定表达株中RNAi的时间依赖性效应

12EGFP-HEK293H稳定表达株中RNAi的剂量依赖性效应

13psh-diEGFP介导c-myc基因的时间和剂量依赖性RNAi效应

14psh-Dicer介导Dicer基因的RNAi效应1

14psh-Dicer介导Dicer基因的RNAi效应2

14psh-Dicer介导Dicer基因的RNAi效应3

讨 论

结 论

参考文献

第二部分：小分子干扰RNA抑制端粒酶活性的表达研究

前言

材料和方法

结果与讨论

结论

参考文献

RNA干涉分子机制研究进展

摘要

前言

1RNAi发现历史及其应用研究

2RNAi分子机制研究进展

3存在问题及展望

参考文献

附录Ⅰ：无精症相关基因的靶siRNAs设计

附录Ⅱ：实验所用主要试剂和溶液

致谢