植物RNA分离与Northern杂交方法的改进及质体信号对核基因表达和叶片形态建成的影响

摘要

本论文对植物RNA分离和Northern杂交分析RNA的方法进行了改进。并研究了质体信号对定位于不同细胞器的核基因表达的调节以及叶片形态建成的影响。 第一部分，建立了一种高效经济的植物RNA提取方法。在提取缓冲液中加入蔗糖、氯化钾和镁离子以提供对RNA分子的保护。破碎后的细胞于提取缓冲液中裂解后，用酚/氯仿变性并去除内源RNA酶和其他蛋白质，而后用pH5.6的NaAc沉淀RNA。用该方法提取RNA的得率较高，经电泳检测，RNA的完整性很好。RNA印迹分析和RT-PCR也都得到很好的结果。该方法还使实验成本大大降低。 第二部分，系统地考察了溴化乙锭(ethidiumbromide，EtBr)先染RNA对RNA荧光强度产生影响的因素。所得结果显示出，RNA的荧光强度除受先前报道的EtBr浓度影响外，还受变性温度、变性时间和RNA量的影响。由于经EtBr先染的RNA的Northern杂交效率与RNA的荧光强度呈负相关，因而对于一个特定的Northern杂交程序的设计，上述这些影响染色灵敏性的因素必须要同时考虑，以使染色的灵敏性与杂交效率得到很好的结合。当使用异源DNA为探针时，随着RNA样品中EtBr浓度的升高，Northern杂交效率要比用同源RNA探针降低得快。我们提出，对于在分子生物学中经常用到的异源DNA探针与EtBr先染的RNA所作的Northernz杂交，最好的结果是当先染RNA的EtBr浓度不超过30μg/mL。这一浓度要低于使用同源RNA探针时的50μg/mL的EtBr浓度。 第三部分，考察了叶绿体发育缺陷的叶绿素(Chlorophyll，Chl)减少的突变体油菜Cr3529中Lhcb基因表达及Chl生物合成前体物质的含量。所得结果显示出，四叶期突变体油菜中LhcbmRNA含量高于野生型，但Lhcb基因表达的光响应性、节律性以及组织特异性都没有发生改变。表明Cr3529中与叶绿体发育状态一致的光合核基因的协调表达受到影响。对Chl生物合成前体物质的测量结果显示出：Cr3529Chl的生物合成部分的阻断于合成的早期，这导致了进入到Chl生物合成途径的卟啉底物原卟啉Ⅸ和Chl生物合成的第一步特异性反应的产物镁原卟啉Ⅸ的含量都有降低。我们讨论了Lhcb基因表达在LHCⅡ生物发生和天线大小控制方面的作用。通过将Cr3529中卟啉含量及光合核基因转录本水平与其它的抑制剂和突变体中的研究结果比较，表明原卟啉Ⅸ和镁原卟啉Ⅸ的水平在调节光合核基因表达中具有特异性作用。我们提出它们的水平被Mg-螯合酶的催化亚基，H亚基以连续的方式感知，并将这一信号传递到细胞核，使光合核基因的表达与叶绿体的功能状态协调起来。 第四部分，考察了质体信号对质体和非质体光合功能蛋白编码核基因和线粒体蛋白编码核基因表达以及叶片形态建成的影响。在叶绿体发育缺陷的突变体油菜Cr3529中，编码质体蛋白的核基因Lhcb1和RbcS，编码过氧化物酶体乙醇酸氧化酶的核基因GLO以及线粒体交替氧化酶核基因Aox1的转录本都被维持着至少与野生型相当的水平。而用质体蛋白翻译抑制剂林可霉素抑制叶绿体发育后，野生型油菜中这3类基因的转录本水平都降低，而GLO受抑制的程度最小。在叶绿体发育同样被抑制的突变体油菜中，这3类基因表达的抑制被解除，其转录本水平都至少是林可霉素处理的野生型油菜中的2倍。这些结果表明，Cr3529中调节质体和非质体功能蛋白编码核基因以及线粒体蛋白编码核基因表达的质体信号受到了损伤，而且编码定位于不同细胞器蛋白的核基因对质体结构与功能状态的敏感性不同。Cr3529子叶发育初期的形态学观察也显示出差异，表现为细胞排列方式以及细胞层数的变化。Cr3529中定位于不同细胞器的核基因表达与叶片形态结构的变化表明，调节基因表达与叶片发育的质体信号是不同的。

目录

文摘

英文文摘

第一部分一种高效经济的高质量植物RNA提取方法

1.引言

2.材料和方法

2.1植物材料

2.2主要试剂

2.3 RNA提取方法

2.4 RNA的完整性及质量检测

3结果与讨论

3.1方法的建立

3.2 RNA质量检测

3.3小结

参考文献

第二部分澳化乙锭先染RNA对RNA荧光强度及以异源DNA为探针的Northern杂交效率的影响

1.引言

2.材料和方法

2.1植物材料

2.2 RNA的提取及甲醛变性胶电泳

2.3 Northern杂交

3.结果与讨论

参考文献

第三部分Cr3529四吡咯代谢及Lhcb基因表达表明一个由叶绿素生物合成前体物质介导调节光合核基因表达的质体信号模型

1.引言

2.材料和方法

2.1植物材料

2.2核酸分离及分析

2.3 Chl含量测定

2.4 Chl前体物质含量的测定

3.结果

3.1突变体油菜Lhcb基因的稳态转录本水平高于野生型

3.2 Cr3529突变影响到了Lhcb基因依赖于叶绿体结构和/或功能的表达调节，而依赖于光的表达调节未受影响

3.3 Cr3529 Chl合成的早期步骤受阻

4.讨论

4.1 Lhcb基因转录在LHCII生物发生中的作用

4.2 Chl b的生物合成决定了植物光合天线的大小，并不决定于受四吡咯生物合成介导的质体信号调节的Lhcb基因的转录

4.3 Cr3529中调节光合核基因表达的质体信号通路受到影响

4.4 Lhcb基因转录的维持和质体信号的产生并不依赖于完整结构的叶绿体

4.5 Chl生物合成前体物质对Lhcb基因转录的调节

4.6一个由ChlH感知进入到Chl合成途径的卟啉流量介导的质体信号模型

参考文献

第四部分质体信号对定位于不同细胞器的核基因表达及叶片形态建成的影响

1.引言

2.材料与方法

2.1植物材料

2.2核酸分离及分析

2.3探针来源

2.4叶绿体超微结构观察

2.5叶片形态结构的光镜观察

3.结果

3.1林可霉素处理抑制了突变体与野生型油菜的叶绿体发育

3.2 Cr3529突变影响了受控叶绿体结构与功能状态调节的Lhcb和RbcSmRNA的积累

3.3 Cr3529突变影响了受控叶绿体结构与功能状态调节的为非质体定位的光合核基因以及线粒体定位的核基因转录本的积累

3.4 Cr3529子叶的叶片结构受到了影响

4.讨论

4.1 Cr3529中调节定位于质体和非质体的光合核基因以及编码线粒体蛋白核基因表达的质体信号通路受到了损伤

4.2调节叶片形态建成的质体信号与协调基因表达的质体信号是否相同?

4.3定位于质体和非质体的光合核基因以及以及编码线粒体蛋白的核基因对叶绿体代谢状态的敏感性不同

参考文献

文献综述 植物四吡咯生物合成与四吡咯介导的质体——细胞核反向信号

1.引言

2.植物中的四吡咯生物合成途径

3.四吡咯代谢的调控机制

3.1限速步骤：ALA合成

3.2 ProtoⅨ在分支点分配到Fe-螯合酶和Mg-螯合酶的控制

3.3光依赖的合成步骤：被子植物中POR的功能与表达

3.4血红素与四吡咯中间代谢物对植物四吡咯合成的反馈控制

3.5光敏色素

4.质体——细胞核反向信号通路

4.1四吡咯调节光合核基因转录的证据

4.2 Mg-螯合酶与催化亚基ChlH在质体信号中的作用

4.3 Mg-Proto可能是质体——细胞核反向信号分子

4.4拟南芥laf6突变体表明Proto Ⅸ可能是质体信号分子

4.5光信号通路与质体信号通路的相互作用

5.结语

参考文献

致谢

在读期间发表的与本博士论文直接相关的论文

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