盐生杜氏藻光系统Ⅱ主要捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆与表达研究

摘要

在高等植物和藻类中，光系统Ⅱ的外周天线含有大量的主要光捕获复合物(LHCⅡ)和少量的次要光捕获复合物(minor LHC)。这些光捕获复合物是由捕光叶绿素a/b结合蛋白以及相应的色素组成的。LHCⅡ蛋白是光系统Ⅱ的主要捕光叶绿素a/b结合蛋白，由Lhcb基因家族编码。LHCⅡ蛋白数量众多，彼此之间有着很高的同源性。LHCⅡ是类囊体膜上重要的色素结合物，其含量占了类囊体膜蛋白总量的1/3以上，并且结合了50％以上的叶绿素。LHCⅡ的主要功能是光能的吸收和传递，提高捕光面积和捕光效率；此外，LHCⅡ在光能分配的调节以及光保护过程中也具有重要的作用。 在高等植物中，LHCⅡ蛋白被广泛的研究。藻类中的LHCII蛋白在数量和复杂性上与高等植物中的相类似。然而除了衣藻外，藻类中LHCII蛋白基因的组成和分类相关信息却十分缺乏。 盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是一种光合自养型的单细胞绿藻，其有着极强的耐盐性和耐强光能力。在极端条件下盐藻是研究每个LHCII蛋白功能差异的有用模型。高光会导致植物受到损伤，高等植物和藻类能通过多种途径来减少这种损伤。光捕获复合物的负调控就是一种有效的光保护途径。LHCⅡ蛋白基因在转录水平上的调控，对于捕光天线大小的改变至关重要。只有在盐藻中鉴定出完整的LHCⅡ蛋白基因，才能在分子水平上明确这种机制a本文在已经构建了盐藻cDNA文库的基础上，开展了以下内容的研究： 一、4条LhcII基因cDNA全长的克隆。通过制各同源探针，在盐藻的cDNA文库中筛选到了3条新LhcIIcDNA全长序列和1条LhcIIEST序列，并且通过5'RACE，获得了其全长cDNA序列。因此盐生杜氏藻中编码LHCII蛋白的基因至少有5条。借鉴衣藻中的命名方法，本文首次对已克隆到的5条基因进行重新命名：DsLhcⅡ-1(Long等人于1989年报道)、DsLhcⅡ-2.1、DsLhcⅡ-2.2、DsLhcⅡ-3初DsLhcⅡ-4(本文报道)。 二、基因序列内含子-夕f、显子结构的分析。根据4条cDNA各自的3'和5'非翻译区设计出特异引物，从基因组中扩增了其相应的DNA序列，分析其内含子-外显子结构。发现盐藻的4条新的LhcⅡ基因含有5－7个内含子，数量多于衣藻。盐藻DsLhclI-2.1和DsLhclI-2.2的内含子数量、位置以及长度等都十分相似，并且两者的内含子在序列组成上也基本相同。但其5'UTR和3'UTR序列却完全不同，说明这是两条基因。通过对其内含子的分析，可以推测这两条基因很可能是在分子进化中复制而来的。 三、完成了盐藻5条LhcⅡ基因的生物信息学分析。对5条基因及其推演出的蛋白质序列进行了相关的生物信息学分析，发现了盐藻LHCⅡ蛋白的一些的独特性质。例如DsLhcⅡ-2这一类蛋白很可能在杜氏属的其它藻种中普遍存在，以及盐藻LHCⅡ蛋白在转运肽的形成上可能存在着差异。通过构建无根树发现盐生杜氏藻的LHCⅡ蛋白不能归为高等植物LHCⅡ蛋白的任何一类，也不能归为衣藻的LHCⅡ蛋白中去，因此其在进化地位上具有独立性的特征。 四、完成了DsLhcⅡ-3基因受光诱导的mRNA转录水平差异的研究。通过荧光定量PCR的方法，进行该基因的差异表达研究。实验结果表明高光照射和暗环境培养都会降低该基因的mRNA水平。但在高光和暗环境条件下，DsLhcⅡ-3基因的mRNA水平是在不同的时间发生变化的，这可能预示着其在转录调控机制上的差异。该研究内容为今后开展盐生杜氏藻Lhcb基因家族的差异表达奠定了基础。 五、DsLhcⅡ-3基因的原核表达研究。根据盐生杜氏藻DsLhcⅡ-3基因的完整ORF序列设计引物，克隆得到该基因ORF全长，实现了其在大肠杆菌中高效表达。为今后抗体的制备和体外色素结合实验等研究奠定了基础。

目录

前言

第一章同源探针的制备和cDNA文库的筛选

第二章盐生杜氏藻DsLhcⅡ-3基因cDNA的全长克隆

第三章盐生杜氏藻DsLhcⅡ基因组序列的克隆

第四章盐生杜氏藻DsLhcⅡ基因的生物信息学分析

第五章盐生杜氏藻DsLhcⅡ-3基因的差异表达研究

第六章盐生杜氏藻DsLhcⅡ-3基因的原核表达研究

结论

致谢

综述高等植物和藻类中Lhcb基因家族的研究进展

参考文献

在校期间学习情况

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