Maspin在宫颈鳞癌中的表达及其与肿瘤微淋巴管形成的相关性研究

摘要

子宫颈癌发病率在我国女性生殖道恶性肿瘤中居第一位，虽然对宫颈浸润癌的治疗已取得了长足进步，但每年仍有约5万人死于宫颈癌：流行病学资料显示宫颈癌发病年龄呈明显的年轻化趋势。淋巴转移是宫颈癌最重要的转移途径之一，也是影响患者预后的重要因素，目前肿瘤微淋巴管在肿瘤淋巴转移中的作用已引起人们关注。由于长期缺乏特异性的淋巴管标记物，肿瘤淋巴管的研究明显滞后于肿瘤微血管的研究。Podoplanin是近年发现的一种43kd的膜蛋白，已证实是较理想的淋巴管特异性标记物，它的出现有力的推动了肿瘤淋巴管的研究。 Maspin是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的新成员，大量研究提示它在诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤血管生成等方面功能显著，可能是一个功能全面的抑癌基因。微血管和微淋巴管发生的同源性提出了maspin与肿瘤微淋巴管的生成有无相关性的问题。 目的：本课题拟检测maspin及淋巴管特异性标记物podoplanin在宫颈癌组织中的表达：体外实验检测宫颈癌细胞中maspin高表达对宫颈癌细胞增殖能力的影响；雌性裸鼠实验观察移植瘤生长情况以及maspin、podoplanin在移植瘤组织中的表达。探讨maspin在宫颈癌进展中的作用，以及maspin对宫颈肿瘤新生淋巴管生成的影响。 方法：实验分为三个部分。1．采用免疫组化LSAB法对13例正常宫颈组织、15例宫颈CINⅢ组织、62例宫颈鳞癌组织、13例癌转移盆腔淋巴结组织标本进行maspin蛋白表达检测，以podoplanin抗体标记微淋巴管内皮细胞并计数宫颈癌组织中微淋巴管密度(LMVD)；分析maspin表达与宫颈癌临床病理参数以及肿瘤LMVD的关系。2.以maspin真核表达质粒稳定转染宫颈鳞癌siha细胞株(siha-m)。半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染后maspin mRNA表达变化，Westem：Blot及细胞免疫化学检测maspin蛋白表达变化。MTT法测定细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率以检测siha细胞转染maspin后细胞生物学行为的变化。3.雌性裸鼠皮下接种siha-m、siha、siha-pc3三种肿瘤细胞成瘤，检测三组细胞成瘤性、maspin.蛋白表达和LMVD，评价体内环境中maspin表达载体对肿瘤细胞生长和肿瘤微淋巴管生成的影响。 结果： 1.①maspin在宫颈鳞癌(SCC)细胞胞浆、胞核中均有表达，与正常宫颈组织及CINⅢ组织相比表达明显减弱(P<0.05)；SCC Ⅱ期细胞核中maspin的表达较Ⅰ b期明显下降(P<0.05)，二者胞浆maspin表达差异无显著性(P>0.05)；淋巴结转移癌巢maspin表达最弱(P<0.05)。②SCC胞核maspin表达下降与较晚的临床分期、淋巴结转移显著相关(P<0.05)；与浸润深度及组织学分级无相关性(P>0.05)；胞浆maspin表达下降与淋巴结转移显著相关(P<0.05)。LMVD增加与较晚的临床分期、淋巴结转移及高组织学分级显著相关(P<0.05)。③SCC胞核maspin表达与临床分期、LMVD呈显著负相关(P<0.05)；SCC胞浆maspin的表达与LMVD呈显著负相关(P<0.05)；LMVD与临床分期呈显著正相关(P<0.05)。 2.以maspin真核表达质粒稳定转染宫颈鳞癌siha细胞后，用RT-PCR、Westem Blot及细胞免疫化学方法，均证实转染目的基因的siha-m细胞中maspin表达明显增强(P<0.05)；MTT法细胞生长曲线测定、流式技术细胞周期及凋亡率测定均显示siha-m细胞增殖能力明显弱于转染空载体组(siha-pc3)和未转染组(siha)(P<0.05)：siha-m凋亡率显著升高(P<0.05)；siha-pc3与siha组在增殖及凋亡率方面无显著性差异(P>0.05)。 3.maspin重组质粒转染后，阳性克隆siha-m细胞在裸鼠成瘤缓慢，肿瘤体积明显小于空白对照组和空质粒组。免疫组化显示，maspin转染组肿瘤maspin蛋白表达强于空质粒组和空白对照组；maspin转染组肿瘤LMVD明显小于空质粒组和空白对照组(P<0.05)，后两者之间LMVD无显著性差异(P>0.05)。 结论：maspin在宫颈鳞癌组织表达下调，其中胞核maspin表达下调与较晚的临床分期、淋巴结转移及LMVD增加显著相关；胞浆maspin表达下调与淋巴结转移及LMVD增加显著相关：LMVD增加与晚期、淋巴结转移及高组织学分级显著相关，肿瘤微淋巴管可能参与了区域淋巴结的转移。maspin基因能明显抑制宫颈鳞癌siha细胞的增殖，有效减缓肿瘤生长，抑制肿瘤微淋巴管生成。maspin基因抗淋巴管生成的功能将成为新的研究热点，可望成为宫颈鳞癌基因治疗的新靶点。

目录

论文说明：英语缩略词表

声明

前言

第一部分：maspin在宫颈鳞癌中的表达及其与肿瘤微淋巴管的相关性研究

材料和方法

结果

讨论

附图一

附表一

第二部分：maspin在宫颈鳞癌的体外研究

材料和方法

结果

讨论

附图二

第三部分：maspin与肿瘤微淋巴管生成的动物实验研究

材料和方法

结果

讨论

附图三

小 结

参考文献

综述一：肿瘤抑制基因maspin的研究进展

综述二：Maspin在肿瘤抑制中的临床研究

致 谢