两种决明子Cassia tora，Cassia obtusifolia蛋白酶抑制剂的纯化、性质与功能研究

摘要

蛋白酶抑制剂是能特异降低靶蛋白酶活力的一类蛋白质或多肽分子，蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶形成特异的蛋白．蛋白复合体，造成竞争性的抑制作用，从而调节植物内源性蛋白酶活力，保护植物免受昆虫和真菌的侵蚀。蛋白酶抑制剂还与动物体内诸多生理生化反应，如血液凝固、肿瘤细胞生长分化、艾滋病病毒的浸染等有密切的关系。这些功能引起了人们对蛋白酶抑制剂的普遍注意与重视。目前已从豆科、葫芦科、十字花科、禾本科和茄科等植物材料中分离得到了丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等三类蛋白酶抑制剂，并有相当多的蛋白酶抑制剂基因被克隆。 决明子(Semen Cassiae)为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L．)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实，晒干，打下种子，除去杂质<'[2]>。决明子入药最早记载于我国的《神农本草经》，列入120种上药(“为君主养命以应天”)之一，性味甘、苦、咸、微寒、无毒，归肝、肾、大肠经。明代李时珍释其名日：“此马蹄决明也，以明目之功而名。”五代吴越时的《日华子本草》认为“作枕治头风明目，胜于黑豆。”现代临床报道其有降低血清胆固醇，治疗高血脂症、高血压等作用。我们分别从两种决明(Cassia tora和Cassia obtusifolia)的种子中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂CTTI(Cassia tora trypsin inhibitor)和COTI(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor)，对它们进行了性质与功能研究。 纯化步骤简述如下：小决明(Cassia tora)的干燥成熟种子研磨粉碎后，去离子水抽提两次，55℃热变性除去部分杂蛋白、30-50％饱和度硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。利用明胶-PAGE和明胶-SDS—PAGE方法分析显示小决明子中含有一种蛋白酶抑制剂，该抑制剂对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均有抑制作用。进一步利用DEAE-Sephadex A50离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析，最后从粗提液中分离纯化得到该蛋白酶抑制剂，命名为CTTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为6.5 kDa。CTTI能形成较强的二聚体，即使在含有SDS的环境中，仍然能够维持二聚体状态。经过纯化，CTTI的纯化倍数达19倍，产率为13％，纯品蛋白质的比活力为317UI/mg蛋白。CTTI在pH2-12的环境中有极强的稳定性，能够保持85％的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高，可以保持近100％抑制活性，在60℃时可以保持82％的抑制活力，当温度继续升高到70℃以上时，其抑制活力迅速下降，表明CTTI具有较高的热稳定性。利用蛋白质内源荧光检测CTTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280 nm时，天然CTTI的最大发射波长为337 nm，是一种典型的含有色氨酸的蛋白质荧光光谱。当CTTI在70℃时加热10分钟后，其荧光峰位置红移至344nm，表明CTTI的构象发生了一定的变化，其分子中的色氨酸残基移向蛋白质分子的表面，变得更为疏水。同时荧光强度也出现一定程度的下降。测定CTTI的远紫外园二色谱，也能反映相似的构象变化。天然CTTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于189 nm，最大吸收负峰位于203 nm，在190 nm处由正吸收值变为负吸收值。CD Pro二级结构软件分析CTTI的二级结构中，含有12.3％α螺旋，30.9％β折叠，20.1％β转角和36.8％无规卷曲。当CTTI被加热变性后，CTTI的远紫外园二色谱发生一定程度的变化。CTTI的β折叠和β转角分别有7.2％和3.7％变为无规卷曲。荧光光谱和园二色谱均表明，当CTTI受到加热后，其分子构象均发生了变化，导致蛋白质变性。 大决明(Cassia obtusifolia)的干燥成熟种子研磨粉碎后，去离子水抽提两次，55℃热变性除去部分杂蛋白、35-55％饱和度硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。利用BAPNA方法确定粗提物具有抑制胰蛋白酶的能力。利用明胶一PAGE和明胶-SDS-PAGE方法分析显示大决明子中含有一种胰蛋白酶抑制剂，进一步利用Trypsin.Sepharose亲和层析和Sephadex G-75分子筛层析，从粗提液中分离纯化得到该胰蛋白酶抑制剂，命名为COTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为20 kDa。COTI在还原与非还原状态下的SDS-PAGE均显示为一条带，表明COTI仅由一条链构成。通过MALDI-TOF测定COTI的精确分子量为19812.55Da。COTI的肽指纹图谱中显示有8个主要的信号峰簇，其中有6个单信号峰和2个双信号峰。利用MASCDOT软件在NCBI上检索，未发现有相似的肽指纹图谱，表明到目前为止，尚未有关大决明胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱报道。COTI在pH2-12的环境中有极强的稳定性，能够保持80％的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高，可以保持近100％抑制活性，但当温度继续升高时，其抑制活力迅速下降，表明CTTI具有较高的热稳定性。COTI在含有二硫苏糖醇的条件下，抑制活性会随时间的推移而逐渐降低。待二硫苏糖醇处理120分钟后，只保留50％的抑制活性，处理12小时后，COTI的抑制活性完全消失。滴定曲线测定COTI抑制胰蛋白酶的表观抑制常数为0.3 uM，抑制摩尔比为1：1。胰蛋白酶与COTI的复合物实验也证实胰蛋白酶与COTI能形成1：1的复合物。化学修饰实验表明COTI的活性中心含有赖氨酸残基。在模拟胃酸环境中，COTI能较长时间抵抗胃蛋白酶的水解作用，表明COTI是一种较强的抗营养因子。但是当COTI在受到加热、还原或修饰处理后，COTI会不同程度地失去对胃蛋白酶的抵抗能力，其中还原或修饰处理会导致抗水解能力的完全丧失。进一步利用串联质谱分析肽指纹图谱中的部分信号峰，通过De novoSequencing技术测定了部分信号峰中的氨基酸序列。测定的序列在NCBI上检索，发现它们与许多豆科的Kunitz蛋白酶抑制剂有较高的同源性。因此依据COTI的生物化学性质诸如COTI只由一条多肽链构成，分子量介于18-22 kDa范围，只有一个活性中心，对还原剂的不稳定性以及氨基酸一级序列的同源性，我们推测COTI属于Kunitz抑制剂家族。更为重要的是，体外分析酶活性的实验表明，当COTI的浓度为40ug/ml时，能够抑制菜青虫中肠碱性蛋白酶60％的活性，并且COTI的抑制能力与大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂相当。体内喂食实验结果显示，当喂食时间长达6天后，喂食COTI的实验组相对于喂食牛血清白蛋白的对照组，体重减轻30％。此结果表明COTI能够抑制菜青虫的生长，这为进一步开发抗菜青虫的生物试剂奠定了一定的基础。利用蛋白质内源荧光检测COTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280 nm时，天然COTI的最大发射波长为313 nm，表明COTI的荧光只来自于分子中的酪氨酸残基，而并非来自色氨酸残基。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，COTI的荧光光谱发生较大的变化。首先313 nm的荧光峰的荧光强度减少12％，其次在345 nn处新发生一个色氨酸的荧光峰。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，313 nm的荧光峰的荧光强度减少78％。测定COTI的远紫外园二色谱，也能反映相似的构象变化。天然COTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于187 nm，最大吸收负峰位于200 nm，在190 nm处由正吸收值变为负吸收值。CD Pro二级结构软件分析COTI的二级结构中，含有4％a螺旋，26.7％β折叠，30.6％β转角和38.2％无规卷曲。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，COTI的远紫外园二色谱发生较大的变化。COTI的β折叠和α螺旋分别减少了15％和增加了28％。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，β折叠和α螺旋分别减少了12％和增加了10％。荧光和园二色谱分析表明：二硫键、疏水作用、范德华力、氢键和静电作用在维持COTI高级构象方面起着重要的作用。当COTI受到加热、还原或修饰处理后，抑制活性的下降是由于其构象改变所致。荧光光谱不仅可以分析COTI的构象变化，还可以分析COTI与胰蛋白酶形成的复合物的构象变化。COTI-胰蛋白酶复合物的荧光光谱中荧光峰位于326 nm。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，荧光峰位置红移至343 nm，荧光强度减少25％；而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，荧光峰位置无变化，荧光强度减少76％。这表明当COTI受到还原或修饰后，COTI与胰蛋白酶无法形成正常的复合物，因而抑制活性下降。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

第一章小决明子蛋白酶抑制剂的分离与性质研究

1.材料与方法

1.1植物材料

1.2仪器与试剂

1.3实验方法

2结果与分析

2.1蛋白质标准曲线的制作

2.2小决明丝氨酸蛋白酶抑制剂的分析

2.3 CTTI的分离纯化

2.4 CTTI的SDS-PAGE

2.5 CTTI的热稳定性

2.6 CTTI的pH稳定性

2.7 CTTI的荧光光谱

2.8 CTTI的园二色谱

3 讨论

小结

参考文献

第二章大决明子蛋白酶抑制剂的分离、性质与抗虫研究

1材料与方法

1.1植物材料

1.2仪器与试剂

1.3实验方法

2结果与分析

2.1固相化胰蛋白酶亲合层析柱的制备

2.2胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备

2.3 COTI的分离纯化

2.4 COTI的SDS-PAGE、明胶-PAGE和明胶-SDS-PAGE

2.5化学修饰

2.6 COTI的热稳定性

2.7 COTI的pH稳定性

2.8 COTI对还原剂的稳定性

2.9 COTI的肽指纹图谱

2.10 COTI的串联质谱结果和De novo Sequencing结果

2.11模拟胃液实验

2.12 COTI表观抑制常数Ki值和抑制摩尔比的测定

2.13胰蛋白酶-COTI形成复合物实验

2.14 COTI的荧光光谱

2.15 COTI与胰蛋白酶复合物的荧光光谱

2.16 COTI的园二色谱

2.17 COTI的氨基酸组成

2.18 COTI的抗虫效果

3讨论

3.1固相化胰蛋白酶的制备(亲合层析胶体制备)

3.2胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备

3.3 COTI的热稳定性

3.4 COTI的pH稳定性

3.5 COTI的模拟胃液实验

3.6 COTI的化学修饰

3.7 COTI的荧光光谱

3.8 COTI的园二色谱

3.9 COTI的同源性确认

3.10 COTI的抗虫研究

小结

参考文献

综述第三章植物蛋白类蛋白酶抑制剂的结构与功能研究

1概况

2蛋白酶抑制剂的分类和结构特征

2.1蛋白酶抑制剂的分类

2.2植物中含有的蛋白酶抑制剂

2.3各类蛋白酶抑制剂的结构特征

2.2巯基蛋白酶抑制剂(CPI)

3蛋白酶抑制剂的作用机理

4生理功能

4.1生物学方面

5蛋白酶抑制剂的应用

5.1医药方面

5.2抗炎抗感染

5.3抗肿瘤

5.4抗辐射

5.5转基因植物和抗害虫

小结

参考文献

致谢

附录