大鼠耳蜗大上皮嵴细胞的体外培养与诱导分化及大、小上皮嵴细胞永生化细胞系的建立

摘要

在哺乳动物听觉系统中，老化、耳毒性药物、感染、过度声刺激及自身免疫性疾病等多种原因可引发耳蜗毛细胞不可逆的损伤，从而导致永久性的感音性聋。耳蜗毛细胞的缺失是引起听觉损伤的一个主要原因，感音性聋影响了全世界上百万人。尽管在鸟类及低等脊椎动物中，毛细胞损伤后可以发生自发替代反应，但在成熟哺乳动物耳蜗尚未能实现毛细胞的再生及功能的恢复。 已经有研究表明新生的哺乳动物耳蜗中存在前体细胞，并且大上皮嵴(greaterepithelialridge，GER)和小上皮嵴(1esserepithelialridge，LER)细胞很可能就是耳蜗毛细胞的前体细胞。同时，最近关于LER细胞的分离与体外培养工作已经相继开展，但迄今为止，从某一限定的耳蜗区域分离出纯GER细胞以及体外培养方面的研究尚无报道。故本研究第一部分提供了一种酶消化和机械分离相结合的新方法，成功地从新生大鼠耳蜗中分离出纯GER细胞，并进行了体外培养及生物学特性的相关探讨。分离出的GER细胞表达Islet1和Islet2(GER/LER特异性标记物)、Phalloidin(标记上皮细胞肌动蛋白)和ZO1(标记上皮细胞间紧密连接)、BrdU(标记分裂中细胞)及Hes1基因，而不表达myosinⅦa(标记成熟毛细胞)及Calretinin(标记不成熟毛细胞)。纯GER细胞在10％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)培养基中呈片状贴壁生长，形似岛状，细胞表现为典型的上皮样多角形外观，具有明显的增殖能力，易形成上皮细胞所特有的“dome”结构，可以实现原代培养10天左右，传代培养2～3代，存活时间不超过4周，扫描电镜(scanningelectronmicroscope，SEM)显示GER细胞培养物呈单层扁平上皮状，细胞间连接紧密，细胞表面可见微绒毛和中心体，未见毛细胞的特异性纤毛束结构；在无血清培养条件下，纯GER细胞易形成具有明显增殖能力的悬浮细胞球，细胞亦呈现典型的上皮样多角形外观，细胞球具有一定表面张力，细胞间连接紧密，可于无血清体外培养条件下存活1周左右。大鼠耳蜗纯GER细胞的成功分离与体外培养体系的建立将会促进哺乳动物毛细胞分化/再生的机制以及基因表达模式方面的研究，这对感音性聋的治疗具有重要意义。 普遍认为哺乳动物内耳的形态形成和毛细胞的产生是局部细胞间的相互作用以及特异基因调控的结果，尤其是“碱性螺旋-环-螺旋”(basichelix-loop-helix，bHLH)基因转录调控因子，其中Math1基因在毛细胞分化过程中司正性调控作用。已有学者通过活体模型或耳蜗器官体外培养等方式证实了GER细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞，Math1/Hath1(Math1的人类同源基因)过表达等外源性因素可以诱导GER区域细胞转化为毛细胞样细胞，但到目前为止，尚无纯GER细胞于体外培养状态下向毛细胞分化方面的相关报道。故本研究的第二部分利用成功建立的大鼠耳蜗纯GER细胞体外培养体系，考察了Hath1基因过表达和/或与耳蜗间质细胞共培养等刺激因素对纯GER细胞的诱导分化作用。发现当以腺病毒为载体，对GER细胞岛培养物进行Hath1基因转染后，GER细胞表现出分化为毛细胞表型(myosinⅦa阳性)的潜能，SEM显示位于细胞岛边缘的GER细胞表面出现细丝状纤毛样结构；同时，与耳蜗间质细胞共培养同样可以诱导GER细胞分化为毛细胞(myosinⅦa/Calretinin/Brn-3C阳性)及支持细胞(p27阳性)表型。本实验进一步证实了内耳毛细胞的产生及成熟可能是局部细胞间的相互作用和/或特异基因调控的结果，同时也为“GER细胞是毛细胞的前体细胞”提供了有力的证据，这为毛细胞分化/再生的影响因素及机制方面的研究开辟了新的思路。 尽管本研究已成功建立了GER细胞的体外培养体系，文献中也有关于LER细胞体外培养的报道，但原代培养操作复杂，不利于大规模应用；原代细胞较短时间会出现老化及某些性状的改变；为纯化而采取的消化等措施也会影响细胞的活性及某些成分的改变。永生化细胞系的建立可解决上述问题。另外，GER和LER体外培养细胞均表现出强大的增殖能力，这也为永生化细胞系的建立提供了可能。SV40逆转录病毒基因体外转化细胞是较为常用且有效的获得永生化细胞系的方法，应用该方法已成功建立了大鼠椭圆囊上皮细胞株(UEC-4)等多种永生化细胞系。故本研究的第三部分利用逆转录病毒介导的SV40大T抗原的基因转染技术，对大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生化细胞系(GLERC-6)的建立进行了初步的探索，证实该方法可行性强，可以实现GER和LER细胞基本表型不变，并且具有持续的增殖能力。另外，Hath1基因的过表达可以诱导GLERC-6细胞向毛细胞表型的分化。这将为今后大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生化细胞系的成功建立以及后续研究工作，比如毛细胞分化和再生的机制以及前体细胞移植治疗感音神经性聋等方面的研究奠定基础。

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英文缩略语表

前 言

第一部分大鼠耳蜗大上皮嵴细胞的分离与体外培养

第二部分大鼠耳蜗大上皮嵴细胞的体外诱导分化

第三部分建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生化细胞系的初步探讨

总 结

参考文献

文献综述 哺乳动物内耳毛细胞再生研究现状

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