骨髓间充质干细胞增加大鼠黄疸肝脏选择性门静脉结扎后肝功能储备的研究

摘要

第一部分，目的:梗阻性黄疸(OJ,Obstructivejaundice),是肝胆胰外科常见的临床病理状态之一。为了更好地了解其发病机制,学者已经尝试建立了多种大鼠梗阻性黄疸引流模型,但胆管堵塞、肠道返流等并发症仍常见。本研究利用显微外科技术,建立了一个稳定的大鼠梗阻性黄疸内引流模型。
　　方法:经过预实验研究,我们制定了规范的手术程序。所有的操作均在显微镜下进行。第一次开腹建立黄疸模型,往胰腺端胆总管插入引流管约3mm长,腹壁固定;二次开腹时引流管放入肝脏侧扩张的胆管,并确认结扎固定牢固。测量大鼠肝重、体重,生化检测,超声检查,超声弹性成像,病理检查,检验引流后肝切除耐受能力等,评估新型模型的稳定性。
　　结果:大鼠黄疸7天内引流后,体重开始上升,血糖和白蛋白恢复到正常水平,营养状态明显好转;未见后期胆管返流、堵塞等并发症。在术后第一天,少数大鼠可见一过性的淀粉酶和脂肪酶升高,但很快下降到正常水平。胆管引流后,各项生化指标,肝重体重比,超声弹性值,肝脏病理改变均可恢复到正常水平。胆道引流七天后,有六只大鼠行85％肝切除,全部存活;术后肝再生好。
　　结论:采用显微外科技术,我们建立了一个新型稳定的大鼠梗阻性黄疸内引流模型,特别适合于需要做长期胆道引流的研究。
　　第二部分，目的:肝门部胆管癌(Hilarcholangiocarcinoma,HCCA)侵袭性强。为达到无瘤切缘,常要进行大范围肝切除,但带来严重的近期并发症是残留肝脏的功能衰竭。近年来,骨髓间充质干细胞(BMSCs,bonemarrowderivedmesenchymalstemcells)被用于肝病临床治疗和基础研究。本研究旨在探析选择性胆管引流(SBD,Selectivebiliarydrainage)联合选择性门静脉结扎(SPVL,SelectivePortalveinligation),附加BMSCs治疗后,能否更快更多的增加黄疸肝脏的肝功能储备。
　　方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代BMSCs。流式细胞技术鉴定细胞表型;经不同方式诱导,茜素红染色检验成骨分化能力,油红O染色检验成脂能力。建立黄疸模型后,动物被随机分为三组,分别为SBD组,SBD+SPVL组和SBD+SPVL+BMSCs干预组。每组分三个观察时间点,分别为干预后第1、3、7天。观察比较三组之间肝重体重比、脾重体重比、99mTc-GSA放射性计数、ICG清除率测试、血清生化指标的差异。Westernblot法检测肝组织中紧密连接蛋白Occludin表达;ELISA法检测IL-1β在肝脏的表达;免疫组织化学法观察增生肝脏Ki-67表达。
　　结果:成功培养雄性大鼠原代BMSCs。流式细胞仪检测结果显示,培养的第3代大鼠BMSCs表达CD90,阳性率为93.28%;细胞在体外可被诱导,具备成骨和成脂分化能力。大鼠OJ14天后,超声杨氏弹性模量值较OJ7天时显著升高,此时肝脏耐受70%肝切除能力差,所以选择,建立黄疸14天大鼠模型,进行实验干预。SPVL后,BMSCs门静脉输入可以加快非结扎侧肝脏更快的生长,并且结扎侧肝脏的萎缩更加明显。CM-Dil标记的BMSCs,在术后24小时,聚集于大血管周围;术后7天,随着细胞的分裂迁移,在肝脏实质呈弥漫分布,同时CM-Dil膜标记随细胞分裂减弱。干预后第1、3天,SBD+SPVL+BMSCs组下肝叶的放射性计数显著高于SBD+SPVL组,分别为192.3±15.8vs.158.7±23.1和274.2±10.2vs.225.3±29.8,p<0.05;第7天两组之间差异不显著。和SBD+SPVL组相比,在干预后第3、7天,SBD+SPVL+BMSCs组的血清TBIL和ALP值降得更快更低。SBD+SPVL+BMSCs组增生侧肝脏组织IL-1β浓度低于其余两组,在第1、3天表现的更加明显。SBD+SPVL+BMSCs组增生肝脏Ki-67阳性细胞数在干预后迅速上升,第三天时占到22±5%。Occludin蛋白的表达在第三天时明显升高,以SBD+SPVL+BMSCs组的升高最为明显,在干预后第7天时仍维持在高水平。
　　结论:选择性胆道引流联合非引流侧门静脉结扎,门静脉输注BMSCs,能改善肝功能,减轻肝脏的炎症反应,修复肝细胞,加速肝再生,更加高效的增加黄疸肝脏储备。

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目录

第一部分利用显微外科技术建立稳定的大鼠梗阻性黄疸内引流模型

中文摘要

英文摘要

前 言

正 文

1. 材料和方法

1.1 动物准备、管理及分组

1.2 实验模型的建立

1.3 实验模型的评估

1. 4 统计分析

2. 结果

2.1.总体情况

2.2. 胰腺损伤的评估

2.3.肝脏损伤及引流后的恢复

2.4.引流后7天，85%肝切除生存率

3. 讨论

参考文献

第二部分骨髓间充质干细胞增加大鼠黄疸肝脏选择性门静脉结扎后肝功能储备

中文摘要

英文摘要

前 言

正文

1. 材料和方法

1.1实验动物、主要仪器和试剂

1.2 70%肝切除的方式

1.3 动物模型的建立及实验分组

1.4骨髓间充质干细胞分离、提取、表型鉴定和诱导分化

1.5 肝重体重比，脾重体重比的计算

1.6 肝脏 99mTc-GSA放射性计数

1.7 ICG清除率测试

1.9 Western blot 法检测肝组织中紧密连接蛋白Occludin表达

1.10 ELISA法检测IL-1β在肝脏的表达

1.11 免疫组织化学法观察增生肝脏Ki-67表达

2 结果

2.1 大鼠模型梗阻性黄疸时间的确定

2.2 BMSCs的形态学观察，表型鉴定及分化

2.3 CM-Dil标记BMSCs情况及其输入肝脏后数量变化

2.4 各组肝重、脾重的变化

2.5 ICG血清清除率

2.6 放射性计数

2.7 SPVL及BMSCs治疗生化指标的变化

2.8 增生肝脏组织中炎症指标的表达

3 讨论

4 结论

参考文献

文献综述

附 录

攻读博士期间发表的论文

致谢