血清外泌体分离鉴定及其内含物与缺血性脑卒中的关联性研究

摘要

目的：
　　分离鉴定缺血性脑卒中患者和健康对照人群血清外泌体，测定血清外泌体之中miR-15a，miR-497，miR-181a等表达水平，以及不同卒中分期的含量变化模式，探讨其作为缺血性脑卒中发病风险预测标志物的可行性。
　　方法：
　　2015年4月至10月，我们在四川省成都市第二人民医院神经内科选取缺血性脑卒中急性期、恢复期患者，和年龄、性别相近的健康对照组。将缺血性脑卒中发生7天之内的患者归为急性发作期组，缺血性脑卒中发生7-30天之内的患者归为恢复期组。病例由神经内科的临床医生进行临床诊断（参照中华神经科学会第四届全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点1995》作为诊断标准），并参照纳入标准和排出标准。抽取肘静脉血液，采用PEG沉淀法分离提取外泌体。
　　系列互补性较强的研究方法，被用于鉴定所获得的血清外泌体。采用扫描电镜法，观察外泌体形态特征与大小。采用特异性抗体考马斯亮蓝染色法，对外泌体标志性蛋白质CD9、CD63做定性检测；采用BCA蛋白定量对外泌体中总蛋白量做定量检测。然后，采用Trizol提取血清外泌体中miRNA；采用实时荧光定量 PCR方法检测3组患者血清外泌体中miR-15a，miR-497，miR-181a等表达水平。
　　实验过程中获得的所有数据，采用SPSS21.0相关方法进行统计学分析。所有计量资料均采用平均值±标准差表示，并进行单因素方差分析（ one-way ANOVA）。分类资料组间比较，采用双向无序R×C表资料的独立性检验。并采用 ROC曲线，评价与缺血性脑卒中相关联的miRNAs在缺血性脑卒中发病风险预测中的价值。
　　结果：
　　1.纳入各组志愿者的临床一般情况无统计学差异
　　本研究共收集了30例血清样本。其中，10例正常对照人群样本，10例缺血性脑卒中急性期样本，10例缺血性脑卒中恢复期样本。正常组、急性期组、恢复期组中男女比例无统计学差异（P＞0.05）。正常组、急性期组、恢复期组平均年龄分别为：62.70±1.557，70.70±4.480，66.30±4.284无显著性差异（P＞0.05）。正常组、急性期组、恢复期组在吸烟、饮酒、高血压史、糖尿病史、心脏病史的分布上均无显著性差异（P＞0.05）。正常组、急性期组，恢复期组空腹血糖值水平、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三脂、尿酸含量水平均无统计学差异（P＞0.05）。
　　2.分离获得的血清外泌体具有典型的外泌体形态
　　采用PEG沉淀法对正常组、急性期组、恢复期组的外周血清进行反复的提取，均可以分离得到浅黄色或黄色的固体颗粒。这些分离的外泌体，电镜下可见大小均一，形态椭圆形或圆形的膜性囊泡（部分有囊泡融合现象），直径介于30-100nm之间。由于外泌体被双层脂质膜包被，故可见中央色浅，周边色深，边缘清楚的囊性结构。
　　3.血清外泌体标志物表达水平较高
　　不同组别血清外泌体样本，通过BCA蛋白定量得到的样品（稀释8倍）蛋白浓度在250.8868-902.9671ug/ml之间，符合BCA蛋白标准曲线的线性范围。因此，样品实际浓度在2007.0946-7223.7367ug/ml之间。
　　考马斯亮蓝染色结果提示：在CD63分子质量附近55KD（marke下面第一条带）下方可以观察到条带分布，在CD9分子质量附近34KD（marke下面第三条带）下方亦可观察到条带分布。
　　蛋白质印迹结果显示：CD63在曝光2分钟，显影8分钟之时就可以看到边缘模糊的条带出现；当曝光12分钟，显影8分钟之后，可以看到边缘清楚，形状规则的蛋白条带。CD9在曝光时间达到40分钟，显影9分钟之时才可以看到颜色较淡，分布面积较小的线状条带。
　　4.初步获得缺血性脑卒血清外泌体中miRNA表达趋势
　　采用实时荧光定量 PCR方法，检测三组外周循环血液外泌体中miR-15a， miR-497，miR-181a的表达水平，miR-15a在缺血性脑卒中的急性期组相对表达量均值±标准差为0.3397±0.9810，低于健康对照组的相对表达量0.7132±0.3693，低于恢复期组的相对表达量0.4998±0.2829。正常对照组、急性期组、恢复期组比较没有显著差异（P＞0.05）。miR-181a在缺血性脑卒中的急性期组相对表达量均值±标准差为0.0360±0.0081，低于健康对照组的相对表达量0.7227±0.2555，低于恢复期组的相对表达量0.3462±0.1330。急性期组与正常对照组比较有显著差异（P<0.01），急性期组与恢复期组比较有差异（P<0.05）而正常对照组和恢复期组比较没有差异（P＞0.05）。miR-497在缺血性脑卒中的急性期组相对表达量均值±标准差为0.0852±0.1781，低于健康对照组的相对表达量0.4357±0.1473，低于恢复期组的相对表达量0.3863±0.1526。急性期组与正常对照组比较有显著差异（P<0.01），急性期组与恢复期组比较有差异（P<0.05）而正常对照组和恢复期组比较没有差异（P＞0.05）。
　　5.缺血性脑卒中相关外泌体miRNA的ROC曲线分析
　　对miR-15a、miR-181a、miR-497进行ROC曲线分析，曲线下面积分别为0.494,0.963,0.775。miR-15a，0.494（0.264-0.724）、miR-181a，0.963（0.898-1.0）和 miR-497，0.775（0.597-0.953）。ROC曲线分析是疾病诊断特异性与灵敏性的重要指标，本研究结果提示miR-15a具有潜在的卒中诊断价值。
　　结论：
　　外周血外泌体中miR-181a、miR-497的表达水平与缺血性脑卒中的发生有显著关联，其有望成为缺血性脑卒中发病风险预测的生物标志物。

目录

缩略词表

引言

1.西医对缺血性脑卒中的诊断

2.中医对脑卒中的认识

3外泌体的分泌、组成和功能

4外泌体的分离和鉴定方法研究进展

5. miRNA作为疾病诊断生物标志物的优势

6. miRNA和BCL-2家族

1.材料与方法

1.1研究对象

1.2纳入标准

1.3排出标准

1.4主要仪器

1.5主要试剂

1.6主要使用液的配制

1.7 实验方法

1.8统计学分析

2.实验结果

2.1正常组、急性期组、恢复期组一般情况及生化指标

2.2血清外泌体的分离和提取

2.3透射电镜观察血清外泌体形态及结构

2.4血清外泌体内源性蛋白表达水平检测

2.5缺血性脑卒中miR-15a、miR-181a、miR-497表达趋势

2.6. miRNAs的ROC曲线分析

3.讨论

3.1 PEG沉淀法分离提取外泌体效果评价

3.2缺血性脑卒中相关miRNA的变化趋势

结论

问题展望

参考文献

综述:脑卒中相关miRNA研究进展

致谢

附件1在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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